Redirection universelle des cellules CAR T contre les tumeurs solides via la membrane

Dec 21, 2023

Nature Biomedical Engineering (2023)Citer cet article

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L'efficacité des thérapies par lymphocytes T à récepteurs d'antigènes chimériques (CAR) pour les tumeurs solides est entravée par des difficultés dans la sélection d'un antigène cible efficace, en raison de l'expression hétérogène des antigènes tumoraux et de l'expression de l'antigène cible dans les tissus sains. Ici, nous montrons que les lymphocytes T avec un CAR spécifique de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) peuvent être dirigés contre les tumeurs solides via l'administration intratumorale d'un amphiphile lipide-poly(éthylène)-glycol conjugué au FITC qui s'insère dans les membranes cellulaires. Dans les xénogreffes de tumeurs syngéniques et humaines chez la souris, le «marquage amphiphile» des cellules tumorales a entraîné une régression tumorale via la prolifération et l'accumulation de cellules CAR T spécifiques au FITC dans les tumeurs. Dans les tumeurs syngéniques, la thérapie a induit l'infiltration de lymphocytes T de l'hôte, a déclenché l'amorçage des lymphocytes T endogènes spécifiques à la tumeur et a conduit à une activité contre les tumeurs distales non traitées et à une protection contre la rechallenge tumorale. Les ligands d'insertion de membrane pour des CAR spécifiques peuvent faciliter le développement de thérapies cellulaires adoptives qui fonctionnent indépendamment de l'expression de l'antigène et du tissu d'origine.

La thérapie par cellules T des récepteurs d'antigènes chimériques (CAR) a obtenu un succès clinique dans le traitement de multiples hémopathies malignes1,2,3, y compris plus récemment le myélome multiple4 ; pourtant, sa traduction en tumeurs solides a été difficile5,6,7. L'un des principaux défis présentés par les tumeurs solides est la sélection de l'antigène cible. Les CAR actuels ciblent les auto-antigènes surexprimés ou les protéines de surface cellulaire mutées exprimées par les cellules cancéreuses ; cependant, la sélection d'antigènes pour cibler les tumeurs solides est souvent problématique. D'une part, les antigènes associés aux tumeurs, tels que le récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2) ou la mésothéline, sont souvent également exprimés dans les tissus sains, entraînant des toxicités hors tumeur ciblées8,9,10. D'autre part, l'expression de protéines de surface cellulaire mutées, telles que le récepteur III du facteur de croissance épidermique (EGFRvIII), est limitée aux cellules cancéreuses, mais ces néoantigènes sont souvent exprimés de manière hétérogène, ce qui augmente la probabilité de résistance et/ou de croissance de l'antigène. cellules cancéreuses négatives11. Ainsi, il existe un grand besoin d'identifier des antigènes tumoraux plus optimaux ou de développer des stratégies alternatives pour diriger les cellules CAR T contre les tumeurs solides. Parmi les exemples d'avancées récentes, citons l'optimisation des conceptions de CAR pour améliorer la reconnaissance des cellules tumorales à faible teneur en antigène12,13, les CAR multispécifiques qui reconnaissent plus d'un antigène13,14,15 et les circuits génétiques permettant la logique de détection d'antigène (comme synNotch circuits pour limiter l'expression CAR à la tumeur16,17,18,19). Cependant, ces approches combinatoires deviennent intrinsèquement plus complexes avec chaque antigène supplémentaire, et comprendre comment ces circuits génétiques de cellules CAR T doivent être réglés pour être sûrs et efficaces face à des niveaux d'antigène variés chez les patients reste un problème de traduction complexe.

Un mécanisme immunologique par lequel la thérapie cellulaire CAR T peut combattre l'hétérogénéité antigénique tumorale et la perte d'antigène est le phénomène de propagation d'antigène (ou propagation d'épitopes), par lequel la destruction des cellules cancéreuses par les cellules CAR T favorise la libération d'antigènes tumoraux dans un environnement pro-inflammatoire favorable. microenvironnement, conduisant à l'amorçage des réponses des lymphocytes T endogènes de novo ciblant des antigènes supplémentaires dans la tumeur20. Des preuves de propagation d'épitopes ont été observées dans des études précliniques murines, y compris les cellules CAR T EGFRvIII dans le gliome murin21,22, les cellules CAR T de la sous-unité alpha 2 du récepteur de l'interleukine 13 (IL-13Ra2) dans le glioblastome murin23 et les cellules CAR T CD19 ciblant les tumeurs solides induites pour exprimer CD19 (réf. 24). Pour améliorer la propagation de l'antigène, les cellules transgéniques du récepteur des cellules T et les cellules CAR T ont été conçues pour sécréter le ligand de la tyrosine kinase 3 de type FMS (Flt3L) afin d'étendre les cellules dendritiques à présentation croisée (CD), qui sont essentielles à ce processus25.

Une autre approche du problème de la sélection des antigènes dans les tumeurs solides a consisté à induire thérapeutiquement des antigènes exogènes sur les cellules tumorales pour permettre le ciblage des cellules CAR T. Par exemple, des vecteurs viraux de thérapie génique ou des virus oncolytiques ont été utilisés pour transduire des cellules tumorales avec des antigènes étrangers arbitraires ou des antigènes avec un profil d'effets secondaires connu dans la thérapie cellulaire CAR T (comme CD19) (réfs. 24,26,27) . Il s'agit d'une approche intéressante car les antigènes peuvent être sélectionnés sans se soucier du ciblage croisé des tissus sains, et l'induction de la propagation de l'antigène par l'attaque des cellules CAR T sur les tumeurs transduites favorise les réponses endogènes des cellules T qui limitent l'échappement de la perte d'antigène et fournissent une antitumorale systémique. immunité24,27. Cependant, une limitation translationnelle de l'introduction d'antigènes étrangers via des virus modifiés est l'hétérogénéité et la transduction très variable obtenue par les vecteurs viraux à la fois au sein des tumeurs individuelles et entre les tumeurs d'un patient à l'autre28,29,30.

Nous avons étudié de manière approfondie le comportement de molécules amphiphiles composées de composés thérapeutiques conjugués à des lipides poly(éthylène glycol) (PEG) amphiphiles. Ces conjugués « amp-ligand » présentent plusieurs propriétés utiles pour contrôler la pharmacocinétique et la biodistribution de charges utiles thérapeutiques liées telles que des peptides, des protéines ou de petites molécules31,32,33. Par exemple, les amph-ligands peuvent insérer leurs queues lipidiques dans la membrane plasmique des cellules in vitro et in vivo sans toxicité, conduisant à l'affichage à la surface cellulaire des composés attachés21,31. Après injection parentérale, les amph-ligands circulent également efficacement dans les ganglions lymphatiques drainants (LN) et décorent les surfaces des cellules présentatrices d'antigène (APC)21. Nous avons précédemment exploité cette chimie physique pour décorer les LN APC avec des ligands pour les cellules CAR T, créant un effet vaccinal dans le drainage des LN qui améliorait la prolifération, la fonction et l'efficacité des cellules CAR T21.

Dans cet article, nous rapportons une stratégie pour utiliser des ligands amph comme moyen de rediriger les cellules CAR T contre toute tumeur solide. Nous montrons qu'un conjugué amphiphile de la petite molécule d'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ajouté aux cellules cancéreuses in vitro conduit à la décoration de la membrane plasmique des cellules tumorales, permettant la reconnaissance par les cellules CAR T portant des récepteurs chimériques spécifiques au FITC et déclenchant l'activation des cellules CAR T, la prolifération et la destruction des cellules cibles décorées d'amph-FITC. In vivo, l'injection intratumorale (it) d'amph-FITC suivie d'une perfusion systémique de cellules CAR T spécifiques à FITC conduit à l'activation et à l'accumulation de cellules CAR T dans les tumeurs, accompagnées d'une régression tumorale dans des modèles de tumeurs solides xénogreffes murines et humaines. L'activité des cellules CAR T stimulée par l'Amph-FITC a également déclenché l'amorçage d'une réponse des cellules T endogène spécifique à la tumeur, induisant des réponses «abscopales» contre les tumeurs distales non traitées et une mémoire immunitaire contre le rechallenge tumoral. Par conséquent, les cellules CAR T dirigées par amph-FITC peuvent fournir une approche pour une régression tumorale sûre et efficace et pour une immunité antitumorale systémique qui peut être appliquée à toute tumeur solide, quel que soit le tissu d'origine ou le génotype malin.

Nous avons envisagé que les propriétés d'insertion dans la membrane des conjugués PEG-lipides pourraient être utilisées pour décorer les cellules tumorales avec des ligands pour un CAR, « peignant » la tumeur pour qu'elle soit reconnue par les cellules CAR T. Dans ce contexte, le choix du ligand des cellules CAR T est arbitraire et nous avons choisi d'utiliser le FITC comme composé sûr et non immunogène pour rediriger les cellules CAR T contre les tumeurs. Nous avons émis l'hypothèse que l'administration de 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-PEG-FITC (DSPE-PEG-FITC, ou amph-FITC) permettrait la reconnaissance et la destruction des cellules tumorales par les cellules CAR T spécifiques au FITC. (Fig. 1a).

a, Schéma de la structure amph-FITC, insertion dans les membranes des cellules cancéreuses et reconnaissance par les cellules FITC CAR T. Créé avec Biorender.com. b, c, des cellules de mélanome murin B16F10 ont été incubées avec amph-FITC aux concentrations indiquées pendant 30 min à 37 ° C dans du PBS, colorées avec un anticorps anti-FITC et analysées par cytométrie en flux. Les histogrammes représentatifs des signaux FITC totaux (b) et anti-FITC (c) sont présentés. d, les cellules B16F10 ont été incubées avec des conjugués amph-FITC de PEG MW variable comme dans b aux concentrations indiquées, puis colorées avec de l'anti-FITC pour une analyse par cytométrie en flux. Les intensités médianes de fluorescence (MFI) des signaux FITC (à gauche) et anti-FITC (à droite) sont indiquées. e, Analyse cinétique du MFI anti-FITC de B16F10 cultivé dans du RPMI après marquage dans 100 nM d'amph-FITC. f, histogrammes de cellules cancéreuses du côlon MC38 marquées avec des concentrations titrées d'amph-FITC pour donner la même fluorescence FITC par cellule (en haut). Les cellules cancéreuses ont ensuite été cultivées avec des cellules CAR T 4m5.3-28z à un rapport E:T de 1: 1. g, h, Co-culture de cellules CAR T E2-m28z spécifiques au FITC ou de cellules T témoins non transduites avec des cellules cancéreuses B16F10 (g) ou CT-2A (h) avec ou sans revêtement par 100 nM amph-FITC à une plage de Rapports E:T. Montré sont moyenne ± sd à partir d'échantillons en double (tous les réplicats biologiques). Les valeurs P ont été déterminées par ANOVA à deux facteurs. NS, non significatif ; ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Données source

Nous avons d'abord évalué le marquage des cellules cancéreuses in vitro en incubant amph-FITC avec des cellules de mélanome murin B16F10 pendant 30 min à 37 ° C. L'analyse par cytométrie en flux des cellules de mélanome a révélé une association dose-dépendante de l'amph-FITC avec les cellules (Fig. 1b), et le FITC a été exposé sur les surfaces cellulaires, comme l'a révélé la coloration ultérieure des cellules recouvertes d'amph-FITC avec un anti-FITC anticorps (Fig. 1c). De même, l'amph-FITC pourrait également s'associer et être exposé à la surface des cellules de carcinome du côlon murin MC38 et des cellules de glioblastome murin CT-2A (Fig. 1a, b supplémentaires). Il est connu que la localisation physique des épitopes CAR sur les antigènes cibles (plus proches ou plus éloignés de la membrane cellulaire) a un impact sur la signalisation des récepteurs chimériques et l'activation de CAR T34,35. De plus, nous avons précédemment montré que la longueur de la chaîne polymère sur les amphiphiles PEG-DSPE impacte l'insertion membranaire32. Pour déterminer comment la longueur du lieur PEG de l'amph-FITC affecte l'insertion membranaire et la stabilité du marquage, nous avons incubé des cellules B16F10 avec des molécules d'amph-FITC composées d'une gamme de poids moléculaires PEG (MW) et mesuré la surface cellulaire totale résultante. -exposé au FITC à une gamme de concentrations (Fig. 1d), puis lavé les cellules dans du milieu frais et suivi de la perte de signal FITC sur 48 h (Fig. 1e et Supplémentaire Fig. 1c). DSPE-PEG2k-FITC a obtenu l'insertion la plus élevée à de faibles concentrations et a présenté la plus grande persistance, avec un marquage substantiel encore détectable après 24 h dans du milieu frais.

Nous avons ensuite testé la reconnaissance cellulaire CAR T des cellules B16 décorées avec des molécules amph-FITC. Des cellules CAR T spécifiques au FITC ont été générées en transduisant des cellules T CD8+ murines primaires avec un CAR composé des fragments variables à chaîne unique spécifiques au FITC (scFv) 4m5.3 (réf. 36) ou E2 (réf. 37) fusionnés à un Charnière CD8, domaine transmembranaire CD8, domaine de co-stimulation CD28 et domaine de signalisation CD3ζ similaires à nos conceptions précédemment rapportées21 (abrégé ci-après en CAR 4m5.3-28z et E2-28z, Fig. 2a – d supplémentaire). Pour évaluer comment la longueur du lieur PEG influence cette capacité des cellules CAR T spécifiques au FITC à reconnaître les cellules cibles décorées d'amph-FITC, nous avons incubé des cellules cancéreuses du côlon MC38 avec de l'amph-FITC de MW variable à des concentrations titrées pour donner le même nombre moyen de FITC molécules par cellule (Fig. 1f, en haut), puis a ajouté des cellules CAR T 4m5.3-28z aux cellules tumorales marquées dans une plage de rapports effecteur: cible (E: T). DSPE-PEG2k-FITC et DSPE-PEG3.4k-FITC ont provoqué une activation robuste des cellules CAR T, telle que lue par la sécrétion d'interféron gamma (IFN-γ), tandis que le DSPE-PEG1k-FITC de PM inférieur était beaucoup moins efficace (Fig. 1f, bas). Sur la base de son insertion optimale dans la membrane cellulaire et de ses propriétés de stimulation CAR T, nous nous sommes donc concentrés sur DSPE-PEG2k-FITC pour des études ultérieures. Le marquage DSPE-PEG2k-FITC a déclenché l'activation des cellules CAR T E2-28z accompagnée d'une sécrétion de cytokines et d'une destruction efficace des cellules B16F10 et des cellules de gliome murin CT-2A par les cellules FITC CAR T (Fig. 1g, h). Ainsi, avec cette molécule amph-FITC optimale, diverses cellules cancéreuses peuvent être marquées pour une activation efficace des cellules CAR T et la destruction des cellules cibles.

Nous avons ensuite évalué le marquage tumoral in vivo après l'injection d'amph-FITC, en utilisant une dose d'amph-FITC (10 nmol) que nous avions précédemment jugée efficace pour stimuler les cellules CAR T21. Après une seule injection dans des tumeurs B16F10 établies, l'amph-FITC a marqué de grandes régions de la tumeur comme l'a révélé l'histologie (Fig. 2a). Pour évaluer la fuite potentielle d'amph-FITC à l'extérieur de la tumeur dans les tissus sains environnants, nous avons analysé des coupes tumorales et des tissus non tumoraux adjacents par immunohistochimie. Bien que ses injections aient conduit à l'accumulation d'amph-FITC près des bords des tumeurs dans certains cas, nous avons constaté une absorption très faible d'amph-FITC sur les cellules du tissu voisin (Fig. 2b). La quantification du FITC extrait de la tumeur, des ganglions lymphatiques drainants de la tumeur (TDLN) et d'autres tissus distaux 24 h après l'injection a révélé que l'amph-FITC restait largement confiné à la tumeur et aux LN inguinaux et axillaires drainants (Fig. 2c). Nous avons émis l'hypothèse que l'absorption d'amph-FITC dans les LN drainants pourrait favoriser la prolifération et la fonction des cellules CAR T en décorant les APC résidant dans les LN, comme décrit dans nos études antérieures utilisant l'amph-FITC comme vaccin contre les cellules CAR T21.

Des souris C57BL/6 ont été inoculées avec 106 tumeurs B16F10 dans le flanc, suivies de l'injection de 10 nmol de DSPE-PEG2k-FITC lorsque les tumeurs ont atteint une taille de 25 mm2. a, Microscopie confocale des tumeurs B16F10 24 h après l'injection d'amph-FITC. Montré est une image histologique représentative de deux tumeurs analysées. b, Un total de 106 cellules B16F10 ont été inoculées à des souris C57BL/6 (n = 4 par groupe) et injectées par voie intratumorale avec 10 nmol d'amph-FITC lorsque les tumeurs avaient une taille d'environ 25 mm2. Deux heures plus tard, les tumeurs ont été isolées avec le tissu conjonctif voisin, cryosectionnées et colorées avec un anticorps anti-Trp1 pour identifier les cellules de mélanome, l'anti-FITC et une coloration de la membrane cellulaire. Sont présentées des coupes représentatives d'un témoin PBS et de deux tumeurs injectées par amph-FITC. Barres d'échelle, 200 μm. c, Biodistribution de l'amph-FITC 24 h après son injection dans les tumeurs B16F10 (n = 5 animaux par groupe). d, Parcelles représentatives de cytométrie en flux de tumeurs B16 injectées par amph-FITC (fermées sur des cellules CD45-) colorées avec de l'anti-FITC pour détecter l'antigène exposé à la surface. e, Immunophénotypage de tumeurs B16F10 chez des souris sans LD préalable à 1, 24 et 48 h après l'injection d'amph-FITC, quantifiant la proportion de cellules doublement positives FITC+ anti-FITC+ (à gauche) et la densité de cellules FITC+ anti-FITC+ dans le tumeur (à droite) (n = 5 animaux par groupe). Tous les réplicats sont des réplicats biologiques. Les valeurs P ont été déterminées par le test U de Mann – Whitney ( d ) ou le test t de Student non apparié ( e ). Montré sont moyenne ± sd NS, non significatif ; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Données source

L'analyse par cytométrie en flux a montré que le FITC était absorbé par une grande proportion de cellules tumorales 24 h après l'injection et restait accessible aux surfaces cellulaires, comme détecté par coloration avec un anticorps anti-FITC (Fig. 2d). Comme prévu, parmi les nombreux types de cellules de la tumeur, les cellules cancéreuses et les cellules hôtes (c'est-à-dire les cellules myéloïdes infiltrantes et les lymphocytes T) ont été marquées au FITC (Fig. 2e et Supplémentaire Fig. 3a), avec environ 40 à 60 % de chaque type de cellule portant du FITC exposé de manière extracellulaire après 1 h, et 20 à 40% des cellules portant encore du FITC exposé à 24 h (Fig. 2e, à gauche et Fig. 4 supplémentaire). Cependant, en raison de leur abondance relative, numériquement à 24 h, la grande majorité des cellules décorées en surface avec du FITC étaient des cellules cancéreuses (Fig. 2e, à droite). Étant donné que la lymphodéplétion (LD) couramment utilisée pour favoriser la greffe de cellules CAR T pourrait affecter l'absorption d'amph-FITC, nous avons également effectué une analyse de la distribution cellulaire du FITC chez les animaux ayant reçu LD par 5 Gy irradiation corporelle totale (TBI) 24 h avant l'injection d'amph-FITC . Le prétraitement LD a considérablement appauvri les cellules immunitaires et favorisé le marquage des cellules cancéreuses dans une proportion encore plus grande (Figs. 3b, c et 4 supplémentaires). Dans l'ensemble, ces données indiquent que son administration limite efficacement la disponibilité de l'amph-FITC à la tumeur et aux TDLN, conduisant à un marquage FITC robuste à la surface des cellules cancéreuses.

Ensuite, nous avons caractérisé la capacité des cellules CAR T spécifiques au FITC à reconnaître les tumeurs injectées avec de l'amph-FITC, et avons suivi l'expansion des cellules CAR T et la localisation tumorale via l'imagerie par bioluminescence. Les souris porteuses de tumeurs B16F10 ont été lymphodéplétées par TBI, suivies d'un transfert adoptif de cellules CAR T E2-28z exprimant la luciférase de luciole. À partir de 2 jours plus tard, l'amph-FITC a été administré par voie intratumorale et tous les 3 jours par la suite pour marquer à nouveau toutes les cellules tumorales qui n'avaient pas encore été tuées par les cellules CAR T (Fig. 3a, CAR T + IT FITC). Nous avons choisi d'en administrer la première dose d'amph-FITC après l'administration de CAR T afin de maximiser le temps nécessaire aux cellules CAR T pour rencontrer des cellules tumorales décorées avec un niveau élevé de ligand FITC. Pour soutenir davantage l'attaque des cellules CAR T sur les tumeurs peintes au FITC, nous avons également testé dans un groupe séparé l'effet du transfert de cellules CAR T (± it amph-FITC) combiné à une injection sous-cutanée bilatérale une fois par semaine d'amph-FITC avec le stimulateur des gènes de l'interféron (STING) agoniste cyclique-di-GMP adjuvant comme rappel de vaccin. Cette injection cible l'amph-FITC vers les DC dans les LN drainants et agit comme un vaccin pour les cellules CAR T, déclenchant l'expansion des cellules CAR T et une fonctionnalité accrue comme nous l'avons signalé précédemment21. L'imagerie par bioluminescence des cellules CAR T transférées à des souris en l'absence de traitement amph-FITC a révélé un faible degré d'expansion des cellules CAR T E2-28z sur 14 jours sans infiltration substantielle de tumeurs (Fig. 3b, c). L'administration de cette vaccination amph-FITC ou amph-FITC a déclenché individuellement l'expansion des cellules CAR T, mais la vaccination amph-FITC seule a déclenché une accumulation plus importante de cellules CAR T près du site d'injection du vaccin près de la base de la queue plutôt que dans la tumeur. En revanche, l'amph-FITC a entraîné une expansion totale comparable des cellules CAR T au cours des 7 premiers jours, mais une plus grande accumulation au site de la tumeur (Fig. 3b, c). L'ajout du rappel de vaccin au traitement amph-FITC n'a pas eu d'impact notable sur l'expansion ou l'accumulation globale des lymphocytes T au site de la tumeur. Nous avons répété cette expérience en traitant les tumeurs CT-2A et l'analyse des tumeurs traitées au jour 12 a révélé une infiltration substantielle de cellules T dans toute la tumeur (très probablement par des cellules CAR T en raison de la proximité temporelle avec LD) (Fig. 3d, e). Nous avons également analysé l'infiltration de cellules CAR T E2-28z dans les carcinomes du côlon MC38 et avons constaté une augmentation de l'abondance de cellules CAR T à la fois dans le sang périphérique et dans la tumeur après le traitement amph-FITC (Extended Data Fig. 1a – c). Ainsi, ce traitement amph-FITC avec et sans prise en charge de la vaccination amph-FITC conduit à une expansion significative de la population de cellules CAR T et à une infiltration des tumeurs par les cellules CAR T E2-28z.

a, Schéma et chronologie du traitement des tumeurs B16F10, y compris le vaccin de rappel CAR T. Créé avec Biorender.com. b,c, Localisation des cellules FLuc+ E2-m28z FITC CAR T chez des souris porteuses de tumeur B16F10 au jour 8 (b) et quantification de l'éclat de la souris entière (en haut) et de la tumeur (en bas) (c) (n = 5 animaux par groupe , répliques biologiques). Le cercle pointillé blanc indique l'emplacement de la tumeur du flanc. d, Immunohistochimie représentative sur les tumeurs CT-2A traitées avec ce vaccin amph-FITC ± amph-FITC, coloration pour CD8, au jour 12 post-transfert adoptif. Barre d'échelle, 50 µm. e, Quantification des lymphocytes T CD8+ par mm2 par champ de vision (FOV) dans 10 FOV par tumeur, n = 10 FOV par condition. Les répliques sont des répliques techniques permettant de capturer l'infiltration des lymphocytes T à travers de nombreux FOV au sein de la tumeur. Les valeurs P ont été déterminées par ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc de Tukey. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne (c) et de l'écart-type (e). NS, non significatif ; ****P < 0,0001.

Données source

Nous avons ensuite évalué l'impact thérapeutique du transfert de cellules CAR T ciblant le FITC combiné à la vaccination amph-FITC et amph-FITC dans les modèles de tumeurs B16F10 et CT-2A, en suivant les délais expérimentaux décrits dans les Fig. 3a et Fig. 4a, respectivement. . Nous avons d'abord testé le traitement du modèle B16F10 hautement agressif et peu immunogène, et évalué le traitement avec ou sans l'inclusion d'un rappel du vaccin amph-FITC. Comme le montre la figure 4b, les cellules CAR T E2-28z redirigées par l'amph-FITC ont stoppé la progression tumorale pendant environ 2 semaines et prolongé la survie; l'ajout du rappel du vaccin amph-FITC a montré une tendance à une régression tumorale légèrement meilleure et à une prolongation de la survie, augmentant la survie médiane de 3 jours. Pour déterminer si la méthode de LD a un impact sur la réponse à cette thérapie, nous avons également testé le traitement en utilisant le régime de chimiothérapie clinique LD de cyclophosphamide et de fludarabine avant le transfert de cellules CAR T, et avons observé une activité antitumorale similaire (Extended Data Fig. 2a).

a, Schéma et chronologie de la thérapie pour la thérapie tumorale CT-2A. b, Croissance tumorale et survie globale de souris C57BL/6 (n = 5 animaux par groupe) portant des tumeurs B16F10 traitées avec des lymphocytes T CAR E2-28z comme sur la figure 3a avec les combinaisons indiquées. c, Croissance tumorale de souris C57BL/6 porteuses de tumeur CT-2A (n = 5 animaux par groupe) traitées avec des lymphocytes T amph-FITC, FITC CAR et un vaccin composé uniquement de lymphocytes T CD8+ ou d'une combinaison de lymphocytes T CD4+ et CD8+ . d, Croissance tumorale et survie après traitement de souris porteuses de tumeur CT-2A (n = 5 animaux par groupe) avec des CAR avec des affinités faibles (E2.7), moyennes (E2) et élevées (4m5.3) pour le FITC, y compris il amph-FITC et vaccin. e,f, Croissance tumorale (e) et survie (f) de souris porteuses de tumeurs CT-2A traitées avec des CAR portant des domaines co-stimulateurs CD28 ou 4-1BB sur une gamme d'affinités de liaison en combinaison avec IT amph-FITC et amph -Vaccination FITC (n = 5 animaux par groupe). Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne. Tous les réplicats sont des réplicats biologiques. Les valeurs P ont été déterminées par ANOVA à deux voies (courbes de croissance tumorale) et test du log-rank (Mantel-Cox) (courbes de survie). NS, non significatif ; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Données source

Nous nous sommes ensuite tournés vers le modèle de tumeur CT-2A, en tant que tumeur à progression lente plus propice au traitement par immunothérapie, et avons cherché à disséquer les facteurs régissant l'efficacité thérapeutique du traitement FITC CAR T. Tout d'abord, nous avons testé l'effet de la composition CD4/CD8 dans le produit cellulaire CAR T. Le transfert adoptif de cellules CD8 + E2-28z CAR T exclusivement associées à l'amph-FITC et la vaccination ont stoppé la progression des tumeurs CT-2A pendant 3 semaines (Fig. 4c). Bien que la LD seule ait retardé la progression tumorale (Extended Data Fig. 2b), cet effet était beaucoup plus faible que la réponse obtenue en combinant le transfert adoptif avec l'amph-FITC. Fait intéressant, contrairement aux preuves soutenant un rôle important pour les cellules CD4 + CAR T dans des modèles murins humanisés de mésothéliome ou de lymphome38,39, le transfert d'un nombre équivalent de cellules CAR T murines préparées avec un rapport ~ 1: 1 CD8 +: CD4 + était nettement inférieur efficace (Fig. 4c).

Compte tenu de la richesse de la littérature suggérant des effets importants de l'affinité CAR et de la sélection du domaine de co-stimulation sur les résultats de la thérapie CAR T traditionnelle40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, nous avons ensuite évalué l'impact de ces paramètres de conception CAR sur l'efficacité du traitement CAR T redirigé par amph-FITC. Pour moduler l'affinité CAR, nous avons comparé l'efficacité des cellules CAR T portant le scFv E2 spécifique FITC (KD = 2,4 nM) avec des CAR préparés à partir d'un scFv FITC de très haute affinité, 4m5.3 (KD = 300 fM), ou le scFv E2.7 de plus faible affinité (KD = 8,9 nM), qui diffère de l'E2 de type sauvage (WT) par une seule substitution d'acide aminé. Chacun de ces trois variants CAR de scFv a été préparé avec un membre de la superfamille 9 du ligand du facteur de nécrose tumorale CD28 (TNFSF9, ci-après dénommé 4-1BB) pour interroger davantage le rôle de la signalisation co-stimulatrice. Comme le montre la Fig. 5 supplémentaire, les cellules T CD8 + murines ont montré une transduction et une expression efficaces de chacun de ces CAR, bien que les CAR à base de CD28 soient exprimés à des niveaux environ 10 fois plus élevés que les CAR 4-1BB. En tandem avec la vaccination amph-FITC + FITC, toutes ces cellules CAR T spécifiques à FITC ont affiché des niveaux similaires d'efficacité thérapeutique dans le traitement des tumeurs C2TA et l'extension de la survie des animaux, à l'exception de la CAR E2.7-BBz qui était légèrement inférieure. efficace (Fig. 4d–f). Cependant, les CAR avec des domaines co-stimulateurs CD28 ont démontré un contrôle de la croissance tumorale plus précoce que ceux avec des domaines co-stimulateurs 4-1BB, indépendamment de l'affinité du scFv (Fig. 4e). Le CAR E2-28z le plus efficace a suscité des réponses complètes chez 40 % des animaux. Nous avons choisi de nous concentrer sur ce CAR pour des études ultérieures, sur la base de son efficacité thérapeutique et de son expression supérieure.

Nous avons finalement réalisé des expériences visant à optimiser le dosage de l'amph-FITC et la préparation de cellules CAR T à efficacité maximale dans ce paradigme de traitement. Nous avons d'abord évalué l'importance de la fréquence d'administration, car une administration tous les quelques jours pendant plusieurs semaines peut n'être cliniquement réalisable que pour les lésions superficielles dans des maladies telles que le mélanome ou le cancer de la tête et du cou. Fait intéressant, la réduction de la fréquence d'injection à une fois tous les 6 jours n'a pas réduit l'effet thérapeutique (Extended Data Fig. 3a). Enfin, la culture ex vivo de cellules CAR T dans l'IL-7 et l'IL-15 plutôt que dans l'IL-2 traditionnelle est également connue pour favoriser le phénotype de la mémoire centrale (TCM) et augmenter le contrôle de la tumeur50,51,52. Cependant, les cellules FITC CAR T développées dans l'IL-7 et l'IL-15 plutôt que dans l'IL-2 n'ont pas démontré un meilleur contrôle de la tumeur (Extended Data Fig. 3b). Ainsi, nous avons finalisé notre thérapie pour utiliser les cellules CAR T E2-28z développées dans l'IL-2 pour d'autres études.

Une préoccupation majeure avec la livraison chimique d'un ligand CAR T est le potentiel de dissémination de l'amph-FITC pour déclencher l'attaque des cellules CAR T sur les tissus sains. Nous avons constaté que l'administration locale d'amph-FITC marque au minimum les tissus normaux (Fig. 2b) et nous n'avons pas détecté d'inflammation évidente de la peau entourant les tumeurs traitées pendant le traitement, ce qui suggère que l'activité des cellules CAR T reste principalement elle. Cependant, la découverte que les cellules CAR T E2-28z se sont développées dans le sang périphérique après le traitement amph-FITC (Extended Data Fig. 1b) nous a incités à évaluer les toxicités systémiques potentielles. Dans les études thérapeutiques, les souris recevant des cellules CAR T avec la vaccination amph-FITC et FITC n'ont montré aucune perte de poids et ont pris de la masse au fil du temps, ce qui ne se distingue pas des animaux témoins non traités (données étendues Fig. 4a, b). Nous avons mesuré les cytokines sériques 24 h après l'injection d'amph-FITC les jours 3 et 12 après le transfert de cellules CAR T E2-28z dans le modèle de tumeur CT-2A, et n'avons constaté aucune élévation des cytokines inflammatoires, à l'exception d'un faible niveau d'IFN. -γ au jour 3 (données étendues Fig. 4c). Nous n'avons pas non plus détecté d'élévation des enzymes hépatiques alanine transaminase (ALT) ou aspartate transaminase (AST) aux moments correspondants, indiquant une absence de toxicité hépatique (données étendues Fig. 4d). Ainsi, la thérapie avec les cellules CAR T amph-FITC et spécifiques au FITC semble être sûre et bien tolérée.

Nous avons émis l'hypothèse qu'en redirigeant les cellules CAR T contre les lésions injectées, les antigènes tumoraux pourraient être libérés dans un microenvironnement pro-inflammatoire favorable qui entraînerait l'amorçage des cellules T endogènes et l'induction d'une réponse immunitaire antitumorale systémique. Bien que nous ayons utilisé le TBI pour favoriser la greffe de cellules CAR T au début du traitement, il est connu que les lymphocytes se rétablissent rapidement après la LD53, et d'autres études ont rapporté des preuves de réponses immunitaires endogènes amorcées par la thérapie cellulaire CAR T malgré l'utilisation de régimes lymphodéplétifs21,25 . Nous avons d'abord évalué l'infiltration de lymphocytes T CD45.2+ CD4+ et CD8+ hôtes dans des tumeurs CT-2A traitées avec des lymphocytes T amph-FITC et CD45.1+ CAR. Alors que les tumeurs non traitées présentaient de très faibles niveaux de lymphocytes infiltrant la tumeur, le traitement amph-FITC / CAR T a provoqué une infiltration robuste par les cellules T hôtes CD45.2 + (Fig. 5a). Pour évaluer l'induction potentielle de la mémoire des lymphocytes T endogènes par le traitement amph-FITC/CAR T, nous avons restimulé des souris qui avaient rejeté les tumeurs CT-2A en réponse à la thérapie amph-FITC/E2-28z CAR T avec des cellules tumorales sur le flanc opposé. Alors que les souris naïves témoins inoculées avec des cellules CT-2A ont montré une progression tumorale régulière, toutes les souris guéries par le traitement amph-FITC/CAR T ont rejeté le rechallenge, malgré l'absence de FITC dans la nouvelle tumeur (Fig. 5b), suggérant l'induction de la mémoire endogène protectrice des lymphocytes T.

a, cytométrie en flux sur les tumeurs CT-2A traitées au jour 34 après le transfert adoptif de cellules T CD45.2 + FITC CAR, quantifiant les cellules T hôtes CD4 + versus CD8 + CD45.1 + infiltrant la tumeur (n = 4 animaux par groupe). b, des souris porteuses de tumeur CT-2A précédemment guéries avec la thérapie CAR T et amph-FITC ont été restimulées par rapport à des souris naïves avec 106 cellules cancéreuses CT-2A sur le flanc opposé au jour 92 après le transfert adoptif (n = 5 animaux par groupe). c, d, Diagrammes de flux représentatifs des DC (c) dans les tumeurs et TDLN de souris portant des tumeurs tdTomato + CT-2A à 12 jours après le transfert adoptif et la quantification (d) des DC tdTomato + dans le TDLN (n = 3 animaux par groupe pour aucun groupe CAR T, n = 4 pour le groupe CAR T + it FITC). e,f, Expression des marqueurs d'activation CD86 (e) et CCR7 (f) dans les CD TDLN à 12 jours après le transfert adoptif avec des histogrammes représentatifs (n = 3 animaux par groupe pour aucun groupe CAR T, n = 5 pour CAR T + groupe FITC). g, ELISPOT sur la rate de souris porteuses de tumeur CT-2A au jour 37 après le transfert adoptif (n = 5 animaux par groupe). Les splénocytes ont été stimulés avec des cellules cancéreuses CT-2A irradiées. Tous les réplicats sont des réplicats biologiques. Les valeurs P ont été déterminées par le test t de Student non apparié. Les barres d'erreur représentent sd NS, non significatif ; *P < 0,05, **P < 0,01.

Données source

Une étape clé pour l'amorçage des réponses des lymphocytes T endogènes est l'acquisition de l'antigène tumoral par les cellules dendritiques (CD). Pour déterminer si la thérapie amph-FITC/CAR T favorisait l'absorption des DC des débris de cellules tumorales, nous avons traité les tumeurs tdTomato+ CT-2A et avons constaté que les cellules immunitaires, notamment les DC dans la tumeur et le LN drainant la tumeur, devenaient tdTomato+, suggérant l'absorption de antigènes tumoraux (Fig. 5c, d). De plus, davantage de DC dans le TDLN exprimaient les marqueurs d'activation CD86 et CCR7 (Fig. 5e, f). Par conséquent, la redirection des cellules CAR T contre les tumeurs par le biais de la décoration amph-FITC favorise la délivrance d'antigènes et l'activation des APC professionnels qui régissent l'amorçage des cellules T endogènes. Enfin, nous avons testé directement le développement de lymphocytes T endogènes spécifiques à la tumeur après un traitement cellulaire amph-FITC/E2-28z CAR T en restimulant les splénocytes de souris traitées par amph-FITC/CAR T ex vivo avec des cellules tumorales CT-2A irradiées. Comme le montre la figure 5g, la restimulation des splénocytes d'animaux traités avec des cellules CT-2A a confirmé que le traitement amph-FITC/CAR T amplifiait les réponses des lymphocytes T endogènes spécifiques à la tumeur par rapport aux souris porteuses de tumeurs non traitées, bien que l'ajout de vaccin amph-FITC le rappel n'a pas semblé apporter d'avantage supplémentaire par rapport à l'administration d'amph-FITC seule.

Encouragés par la preuve que le traitement amph-FITC/CAR T provoque une stimulation endogène des lymphocytes T, nous avons ensuite évalué si cette thérapie localisée pouvait déclencher des réponses immunitaires antitumorales systémiques. À cette fin, nous avons implanté des tumeurs CT-2A bilatéralement dans les flancs de souris et traité uniquement la tumeur du flanc droit en lui administrant amph-FITC (en combinaison avec la vaccination amph-FITC, Fig. 6a). De manière frappante, les tumeurs injectées (1 °) et non injectées (2 °) ont montré une progression considérablement ralentie et la survie globale des animaux traités a été significativement améliorée (Fig. 6b, c). Nous avons ensuite testé la capacité de l'administration locale d'amph-FITC à susciter une immunité systémique contre les mélanomes B16F10 ; pour ce modèle plus agressif, la tumeur secondaire non injectée a été inoculée plusieurs jours après la tumeur primaire à traiter, pour permettre au temps de réponse des lymphocytes T endogènes de se développer avant l'excroissance rampante de la tumeur distale (Fig. 6d). L'injection de la seule tumeur primaire a entraîné un ralentissement de la croissance de la tumeur traitée et une tendance à ralentir la progression des lésions non traitées, en plus d'une augmentation significative de la survie globale par rapport aux animaux non traités (Fig. 6e, f). Ainsi, la réponse endogène des lymphocytes T initiée par la redirection locale des lymphocytes CAR T avec l'injection d'amph-FITC conduit à une attaque immunitaire des tumeurs distales non traitées.

a–c, des souris C57BL/6 (non traitées n = 10, traitées n = 8) ont été inoculées avec des cellules tumorales CT-2A sur les flancs opposés, puis traitées avec des cellules T FITC-CAR, une vaccination amph-FITC et amph-FITC uniquement dans la 1° lésion. La chronologie et le schéma du traitement (a), la taille moyenne de la tumeur (b) et la survie globale (c) au fil du temps sont présentés. Créé avec Biorender.com. d–f, des souris C57BL/6 (n = 10 par groupe) ont été inoculées avec des cellules tumorales B16F10 sur les flancs opposés, puis traitées avec des lymphocytes T FITC-CAR, une vaccination amph-FITC et it amph-FITC uniquement dans la lésion 1°. La chronologie du traitement (d), la taille moyenne de la tumeur (e) et la survie globale (f) au fil du temps sont indiquées. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne. Tous les réplicats sont des réplicats biologiques. Les valeurs P ont été déterminées par ANOVA à deux voies (courbes de croissance tumorale) et test du log-rank (Mantel-Cox) (courbes de survie). NS, non significatif ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Données source

Nous avons concentré nos études initiales sur des modèles de souris immunocompétentes utilisant des cellules CAR T murines pour permettre l'analyse de la propagation de l'antigène et de l'immunité des cellules T endogènes, mais la capacité du marquage amph-FITC à rediriger efficacement les cellules CAR T humaines contre les cellules cancéreuses humaines était également important pour évaluer . À cette fin, nous avons conçu des CAR spécifiques au FITC qui étaient fortement exprimés dans les cellules T humaines (Fig. 7a). In vitro, les cellules CAR T humaines préparées avec des CAR à base de scFv E2 de haute affinité ou de faible affinité ont présenté une cytotoxicité puissante contre les cellules tumorales de mésothéliome humain MSTO-211H marquées par amph-FITC, indépendamment de l'utilisation de CD28 ou 4 -1BB domaines de co-stimulation (Extended Data Fig. 5a). Ainsi, les cellules CAR T humaines reconnaissent également efficacement les cellules cancéreuses revêtues d'amph-FITC.

a, Expression de FITC CAR humanisés. b, Schéma et chronologie de la thérapie chez les souris NSG. Créé avec Biorender.com. c, d, Imagerie par bioluminescence (c) et quantification (d) du trafic de cellules FLuc+ CAR T chez des souris NSG (n = 5 animaux par groupe). e, croissance tumorale MSTO-211H de souris NSG après traitement avec des cellules CAR T E2-hBBz (n = 10 animaux par groupe). Tous les réplicats étaient des réplicats biologiques. Les valeurs P ont été déterminées par ANOVA à deux facteurs. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne. **P < 0,01 ; ***P < 0,001. NS, non significatif.

Données source

Dans la plupart de nos études sur le traitement des tumeurs murines syngéniques, nous l'avons administré à côté de l'amph-FITC administré par voie sous-cutanée (sc) (avec adjuvant) qui est efficacement absorbé dans les LN drainants comme rappel de vaccin21. Cependant, comme les vaisseaux lymphatiques et les LN périphériques sont défectueux chez les souris immunodéficientes NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) utilisées pour l'évaluation des cellules CAR T humaines, nous avons été limités à la stimulation des cellules CAR T spécifiques au FITC par le biais de l'amph-FITC. Pour tester l'activité in vivo des cellules CAR T répondant aux tumeurs revêtues d'amph-FITC, nous avons inoculé des tumeurs MSTO-211H chez des souris NSG, transféré de manière adoptive des cellules CAR T 4m5.3 ou E2 exprimant la luciférase avec CD28 ou 4-1BB co- domaines de stimulation 7 jours plus tard, puis a traité les animaux avec des doses répétées de celui-ci amph-FITC (Fig. 7b). Contrairement aux cellules CAR T murines, où le transfert d'une population de cellules CAR T CD8 + pures avait une efficacité thérapeutique supérieure à une population mixte de cellules CAR T CD4 + et CD8 +, nous avons constaté que les cellules CAR T humaines proliféraient plus vigoureusement en tant que CD4 + et CD8 + mixtes. population après l'administration d'amph-FITC (Extended Data Fig. 5b), conformément aux études précédentes38,39. Par conséquent, nous avons procédé avec une population mixte de CD4/CD8 pour des expériences sur les lymphocytes T humains. L'analyse des cellules CAR T après le transfert adoptif a montré que ces cellules CAR T humaines étaient composées d'un mélange de cellules mémoire effectrices (Tem) et de cellules mémoire effectrices réexprimant les phénotypes CD45RA (Temra) (Extended Data Fig. 5c, d).

Lors du traitement des tumeurs comme sur la figure 7b, toutes les cellules CAR T ont montré un certain niveau d'accumulation dans les tumeurs entre le jour 13 et le jour 25, mais les cellules CAR T E2-h28z et E2-hBBz ont montré la plus grande accumulation au niveau des sites tumoraux injectés ( Figures 7c,d). Le dénombrement des cellules CAR T dans la rate au jour 40 a également montré la persistance de toutes les cellules CAR T de manière systémique, à l'exception des cellules CAR T 4m5.3-h28z infusées en tant que population CD8 + pure (Extended Data Fig. 5e). En raison de son expression plus élevée, de sa cytotoxicité tumorale in vitro supérieure et de son accumulation robuste dans les tumeurs, nous avons poursuivi avec la construction E2-hBBz CAR pour les études de thérapie par cellules T humaines. En combinaison avec amph-FITC, les cellules CAR T E2-hBBz ont entraîné un rejet complet de la tumeur chez environ 20% des souris et la croissance tumorale a été stoppée dans 60% supplémentaires de la cohorte (Fig. 7e). Aucune toxicité manifeste en termes de perte de poids des animaux ou d'altérations du comportement n'a été notée pendant le traitement jusqu'à des moments tardifs lorsque les groupes traités et non traités ont commencé à présenter des symptômes de maladie du greffon contre l'hôte (GVHD), une limitation connue du modèle de souris NSG. Notamment, l'expansion relative de 13, 3 fois des cellules CAR T induite par le traitement amph-FITC (Extended Data Fig. 5f) a exacerbé la GVHD dans ce groupe, entraînant la mort précoce d'un certain nombre d'animaux qui répondaient au traitement (Fig. 7e ). Par conséquent, l'injection d'amph-FITC apparaît comme une stratégie prometteuse pour rediriger les cellules CAR T humaines contre les tumeurs solides.

Jusqu'à présent, la traduction de la thérapie cellulaire CAR T aux tumeurs solides a été limitée par la nature imparfaite des antigènes tumoraux, avec une expression hétérogène des antigènes et une faible spécificité tumorale entraînant respectivement une résistance au traitement et une toxicité pour les tissus sains8,9,10,11. Nous décrivons ici une thérapie utilisant un conjugué phospholipide-polymère qui, lorsqu'il est administré localement par injection, marque les cellules de la tumeur avec un antigène à petite molécule, le FITC, et marque les cellules cancéreuses pour destruction par les cellules CAR T spécifiques au FITC. Ce traitement a prolongé la survie dans de multiples tumeurs solides murines syngéniques et a également provoqué une régression tumorale dans un modèle de xénogreffe de tumeur solide humaine. Il est important de noter que la cytotoxicité CAR T dirigée par l'amph-FITC a déclenché la libération d'antigènes tumoraux et l'activation des DC, conduisant à l'amorçage des cellules T antitumorales endogènes. Cette immunité endogène était suffisante pour protéger de la rechallenge tumorale et fournit un mécanisme d'attaque immunitaire endogène contre les lésions non injectées.

Cette stratégie permet de contrôler le ciblage tumoral via l'administration locale d'amph-FITC, garantissant que les cellules CAR T peuvent reconnaître efficacement les cellules cancéreuses tout en limitant la toxicité hors tumeur sur cible au niveau des tissus sains distaux. Des études antérieures ont utilisé des cellules CAR T spécifiques au FITC et redirigé ces cellules contre les tumeurs en liant le FITC à des anticorps ciblés sur la tumeur55,56,57 ou à des métabolites tels que le folate58,59,60. Mais la principale limitation de ces approches est que nous manquons d'antigènes cibles appropriés sur la majorité des cancers solides pour la génération de tels commutateurs. Les cellules FITC-CAR T ont été redirigées contre les tumeurs à l'aide d'anticorps anti-CD19 ou anti-CD20 couplés au FITC55,56, mais ces antigènes ne sont exprimés que sur un sous-ensemble de leucémies et de lymphomes, et nous disposons déjà de produits de cellules CAR T efficaces approuvés dans ce paramètre. Plusieurs études ont redirigé les lymphocytes T FITC-CAR en utilisant le trastuzumab, un anticorps ciblant HER2, couplé au FITC55,57, mais il a été démontré en clinique que les lymphocytes T CAR à base de trastuzumab avaient un potentiel de toxicité mortelle chez les patients en raison d'une faible expression. de HER2 sur les cellules épithéliales pulmonaires9. Il s'agit d'une préoccupation générale avec les antigènes associés aux tumeurs tels que HER2, EGFR et récepteur de folate. Malgré des efforts intensifs dans les domaines thérapeutiques des cellules CAR T et des anticorps, jusqu'à présent, l'identification d'antigènes de surface cellulaire largement ciblables et véritablement spécifiques à la tumeur a largement échoué. De plus, même si des ligands de ciblage tels que des anticorps conjugués au FITC étaient injectés par voie intratumorale comme cela est effectué ici pour surmonter ces problèmes, ils sont confrontés au défi supplémentaire que l'expression de l'antigène tumoral peut varier considérablement d'un patient à l'autre, même dans un type de tumeur donné (comme EGFRvIII dans le glioblastome11 ).

Ici, nous montrons une approche entièrement indépendante de l'antigène tumoral qui ne repose pas sur l'identification d'antigènes de surface spécifiques aux cellules cancéreuses. De plus, l'insertion de membrane par amph-FITC devrait permettre la redirection des cellules CAR T contre les tumeurs de manière uniforme entre les patients et les types de tumeurs, en relevant le défi de l'hétérogénéité de l'expression de l'antigène. Bien que les cellules cancéreuses soient capables de développer une résistance à la thérapie cellulaire adoptive ciblant les protéines exprimées nativement par mutation ou régulation négative de l'antigène cible, nous nous attendons à ce que ces mécanismes de résistance soient beaucoup plus difficiles avec l'insertion membranaire CAR-ligand. Comme nous l'avons démontré précédemment21, le processus de marquage amph-ligand est hautement modulaire ; bien que cette étude ait été réalisée avec FITC comme antigène modèle, FITC pourrait être échangé contre une gamme d'autres ligands, y compris, mais sans s'y limiter, un antigène protéique ou peptidique, ou d'autres petites molécules. Le ligand amph-FITC est une entité moléculaire simple et bien définie qui se prête facilement à la fabrication GMP. Les cellules CAR T spécifiques au ligand peuvent être conçues et développées à l'aide des flux de travail existants, sans modification de la production de vecteurs viraux ou de la culture de cellules T ex vivo. Le polymère lipidique DSPE-PEG est un composant central des médicaments approuvés tels que Doxil61, avec un profil de sécurité établi. En outre, si nécessaire, une thérapie combinée avec un vaccin amph-ligand serait transparente, ne nécessitant que l'ajout d'un adjuvant vaccinal approprié, tel que l'agoniste STING utilisé ici.

Des preuves émergent de la capacité de la cytotoxicité médiée par les cellules CAR T à provoquer la propagation de l'antigène dans des modèles de tumeurs solides murines syngéniques21,22,23,24,25, même lorsque des régimes LD sont utilisés avant le transfert adoptif. Bien que les preuves chez les patients aient été plus limitées, l'induction de nouvelles réponses anticorps après la thérapie par cellules CAR T a été rapportée dans le cancer du pancréas62, et un rapport de cas d'un patient traité avec des cellules HER2 CAR T pour un rhabdomyosarcome métastatique a documenté l'expansion oligoclonale des cellules T endogènes63 , suggérant la propagation de l'antigène. Ici, nous avons constaté que la reconnaissance CAR T du ligand amph inséré dans la membrane provoquait des expansions significatives de la réponse antitumorale endogène des lymphocytes T, qui protégeait les souris guéries de la rechallenge avec des cellules cancéreuses parentales en l'absence du ligand CAR et induisait une activité antitumorale contre les lésions distales.

Un inconvénient potentiel de cette approche est la nécessité d'une injection locale d'amph-ligand. Bien que cela puisse limiter l'application de la thérapie aux tumeurs accessibles, les immunothérapies deviennent plus courantes, avec une augmentation exponentielle du nombre correspondant d'essais cliniques64,65. Avec le développement de nouvelles thérapies informatiques, les technologies utilisées pour l'administration de ces agents (telles que les injections guidées par l'image) sont également développées et appliquées plus largement66. Alors que les tumeurs viscérales sont accessibles pour l'injection, les injections répétées peuvent être moins réalisables, et nous étudions activement le nombre minimum d'injections nécessaires pour induire une régression tumorale par la thérapie amph-FITC/CAR T, et prévoyons que seulement deux à trois injections peuvent être suffisant. Nous avons constaté qu'un traitement une fois tous les 6 jours était d'une efficacité équivalente à une administration tous les 3 jours (données étendues Fig. 3a). Notamment, l'immunothérapie virale oncolytique approuvée par la Food and Drug Administration des États-Unis, le talimogène laherparepvec, est administré toutes les 2 semaines pendant au moins 6 mois après l'administration initiale.

Une préoccupation supplémentaire est que la décoration amph-ligand décorera toutes ses populations cellulaires et pas seulement les cellules cancéreuses. Nous avons montré que les prétraitements LD couramment utilisés avant le transfert de cellules CAR T éliminent déjà la majorité de ses cellules immunitaires, ce qui réduit les inquiétudes concernant la redirection des cellules CAR T contre les infiltrats de cellules immunitaires de l'hôte. De plus, ses populations cellulaires telles que les macrophages associés aux tumeurs, les cellules myéloïdes et les fibroblastes associés au cancer sont hautement immunosuppressives et favorisent la tumeur, et il a été démontré dans de nombreuses autres études que leur élimination stimule la réponse immunitaire antitumorale67,68,69,70,71 . Par conséquent, la décoration amph-FITC et la destruction médiée par CAR T de ces populations de cellules hôtes, plutôt que de représenter une toxicité, favoriseraient probablement le rejet de la tumeur.

En résumé, nous avons montré une thérapie cellulaire CAR T universelle entièrement indépendante de la tumeur basée sur l'insertion membranaire d'amph-ligands administrés par voie intratumorale. Cette approche a montré une puissante activité antitumorale contre plusieurs types de tumeurs et chez des hôtes immunocompétents. De manière frappante, la thérapie cellulaire CAR T dirigée par un ligand amph a également induit une réponse endogène des cellules T. Bien que la thérapie cellulaire CAR T ait eu une efficacité impressionnante dans le ciblage des leucémies et des lymphomes exprimant des antigènes ubiquitaires tels que CD19, l'administration de ligands amph-CAR fournit une stratégie pour le traitement universel des tumeurs solides où la sélection des antigènes tumoraux est plus problématique, élargissant considérablement le patient population susceptible de bénéficier d'une thérapie cellulaire adoptive.

DSPE-PEG-FITC (PEG MW 1, 2, 3,4 et 5 kDa) a été acheté auprès de Creative PEGworks (cat. n° PLS-9926 à 9929). DSPE-FITC et DSPE-PEG10k-FITC ont été achetés auprès de Nanosoft Polymers (n° de catalogue 10805) et Nanocs (n° de catalogue PG2-DSFC-10k), respectivement. Le di-GMP cyclique a été acheté chez Invivogen.

Les cellules Phoenix-ECO, B16F10 et MSTO-211H ont été achetées auprès de l'ATCC. Les cellules 293T ont été achetées chez Clontech. Les cellules MC38 et CT-2A-Luc ont été gracieusement fournies par le Dr Dane Wittrup du Massachusetts Institute of Technology (MIT) et le Dr Thomas Seyfried du Boston College, respectivement. Les cellules CT-2A et MSTO-211H ont été transduites de manière lentivirale pour exprimer de manière stable l'EGFRvIII murin et tdTomato ou la mésothéline humaine, respectivement, avec sélection à l'aide de puromycine et tri sur un trieur de cellules BD FACSAria III. Les cellules B16F10, CT-2A, MC38, 293T et Phoenix-ECO ont été cultivées dans du milieu complet de Eagle modifié par Dulbecco (Cytiva; additionné de 10 % de sérum bovin fœtal, 100 U ml-1 de pénicilline et 100 mg ml-1 de streptomycine). Les cellules MSTO-211H ont été cultivées dans du milieu complet du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Cytiva).

Tous les CAR murins contenaient le peptide signal CD8α (MALPVTALLLPLALLLHAARP) suivi d'un Myc-tag (EQKLISEEDL, pour l'analyse de l'expression de la surface cellulaire) et d'un scFv spécifique au FITC dérivé du clone d'anticorps monoclonal 4m5.3 (réf. 36), E2 (réf. 37) ou E2 avec une mutation His-H58-Ala72 ('E2.7'). Les domaines extracellulaires ont été fusionnés aux domaines charnière et transmembranaire CD8α, aux domaines co-stimulateurs CD28 ou 4-1BB et à un domaine intracellulaire CD3ζ, et ont été clonés dans un vecteur rétroviral pMIG. Pour les études d'imagerie par bioluminescence, les lymphocytes T ont été co-transduits avec MI-FLuc-IRES-mCherry, qui était un cadeau de Xiaoping Sun (plasmide Addgene #75020 ; http://n2t.net/addgene:75020 ; RRID : Addgene_75020). Tous les CAR humanisés ont été clonés de la même manière que ci-dessus en utilisant des domaines humanisés, à l'exception que les CAR contenant des domaines co-stimulateurs CD28 ont été appariés avec un domaine transmembranaire CD28. Les CAR humanisés ont été clonés dans le vecteur lentiviral pLenti6.3 (ThermoFisher) sous le contrôle d'un promoteur de cytomégalovirus. Pour les études d'imagerie par bioluminescence, les lymphocytes T ont été co-transduits avec pCDH-EF1-Luc2-P2A-tdTomato, qui était un cadeau de Kazuhiro Oka (plasmide Addgene #72486 ; http://n2t.net/addgene:72486 ; RRID : Addgene_72486 ). L'expression de tous les CAR a été déterminée par coloration par cytométrie en flux pour l'étiquette Myc à l'aide d'un anticorps anti-étiquette Myc (9B11, conjugué PE, signalisation cellulaire) avec analyse sur un cytomètre en flux BD LSR-II.

Pour produire un rétrovirus écotrope pour la transduction de lymphocytes T murins, des cellules Phoenix-ECO ont été transfectées avec un rapport 1: 3 de pCL-Eco et un plasmide de transfert à l'aide d'un kit de transfection de mammifères CalPhos (Takara Bio). Les lymphocytes T murins primaires ont été isolés de la rate de souris WT ou CD45.1+ C57BL/6 à l'aide du kit d'isolement de cellules T EasySep Mouse CD8+ ou du kit d'isolement de cellules T EasySep Mouse (StemCell Technologies) et activés pendant 48 h sur six puits non- Plaques traitées pour culture tissulaire (TC) pré-enduites de 0,5 mg ml-1 anti-CD3 (BioXCell, Clone 2C11) et 5 mg ml-1 anti-CD28 (BioXCell, Clone 37.51) à 106 cellules ml-1 avec 5 ml par puits . Les cellules T ont été cultivées dans du RPMI complet avec du pyruvate de sodium 1 mM, du β-mercaptoéthanol 0, 05 mM et 1 × acides aminés non essentiels du milieu essentiel minimal (ThermoFisher) complétés par 10 ng ml - 1 IL-2 murine (BioLegend). Après activation, les lymphocytes T ont été transduits par spinfection à 3 × 106 cellules par puits dans un milieu complet de lymphocytes T pendant 90 min à 1 100 g et 32 ​​° C avec 10 ng ml-1 de polybrène (Sigma) sur des plaques non traitées au TC pré- recouvert de 15 mg ml-1 RetroNectin (Takara Bio). L'expression de CAR a été dosée par cytométrie en flux 24 h après la transduction; Les cellules T ont été maintenues à une densité cellulaire de 106 cellules ml-1, puis utilisées pour un transfert adoptif ou des tests in vitro à 48 h après la transduction.

Pour les CAR humanisés, le lentivirus pseudotypé G du virus de la stomatite vésiculeuse a été produit par transfection de cellules 293T avec psPAX2, pMD2.G et un plasmide de transfert dans un rapport 2: 1: 2 à l'aide du réactif de transfection Effectene (QIAGEN). Les lymphocytes T humains primaires ont été isolés à partir de couches leucocytaires de donneurs sains (Massachusetts General Hospital Blood Donor Center) à l'aide du kit d'isolement de cellules T EasySep Human CD8+ ou du kit d'isolement de cellules T humaines EasySep (StemCell Technologies) et activés pendant 48 h à l'aide de Dynabeads Human T- Activateur CD3/CD28 (ThermoFisher) à un rapport billes/cellules de 3:1. Les cellules T humaines ont été cultivées dans du RPMI complet additionné de 30 U ml-1 d'IL-2 humaine (PeproTech). Après activation, les lymphocytes T ont été transduits et colorés comme décrit ci-dessus, et utilisés pour le transfert adoptif ou des études in vitro 48 à 72 h après la transduction.

Pour le marquage in vitro des cellules tumorales avec amph-FITC, les cellules tumorales ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1 × et incubées à une densité cellulaire de 106 cellules ml-1 pendant 30 min à 37 ° C avec DSPE-PEGx- FITC, où x = 0, 1, 2, 3,4 ou 10 kDa (Creative PEGworks) dans du PBS. Pour les co-cultures, les cellules cibles ont été marquées simultanément avec 100 nM d'amph-FITC et CellTrace Violet (ThermoFisher); 20 000 cellules cibles ont été ensemencées par puits dans une plaque à fond plat à 96 puits avec des cellules CAR T aux rapports E:T indiqués. Après une incubation de 16 h, les cellules ont été colorées avec du rouge SYTOX (ThermoFisher) pour la cytométrie en flux, et l'IFN-γ dans le surnageant a été quantifié à l'aide d'un kit ELISA IFN gamma non revêtu de souris (Invitrogen).

Pour évaluer la biodistribution de l'amph-FITC après son injection, des souris C57BL/6 (6 à 8 semaines, Jackson Laboratory, n = 5) ont été inoculées par voie sous-cutanée avec 106 cellules tumorales B16F10. Une fois que les tumeurs avaient une superficie d'environ 25 mm2, 10 nmol de DSPE-PEG2k-FITC (Creative PEGworks) ont été injectés par voie intratumorale. Après 24 h, les tissus (tumeur, foie, rein, rate, moelle osseuse et ganglions lymphatiques axillaires et inguinaux) ont été homogénéisés dans de l'éthanol (pH 8,0–8,5) et la fluorescence du surnageant a été quantifiée sur un lecteur de plaque FlexStation 3 (Molecular Devices, excitation 495 nm, émission 519 nm).

Pour les études de localisation cellulaire, des souris porteuses de tumeurs MC38 ont reçu une injection intratumorale de 10 nmol de DSPE-PEG2k-FITC, et 24 h plus tard, les tumeurs ont été digérées par voie enzymatique à 37 ° C pendant 30 min avec 1 mg ml-1 collagénase D et 0,2 mg ml- 1 DNase I en milieu RPMI complet avant dissociation mécanique à travers un tamis cellulaire de 70 µm. Les échantillons ont été colorés à l'aide des anticorps suivants : PE-Cy7 anti-CD45 (clone 30-F11, BioLegend), BV605 anti-CD11b (clone M1/70, BioLegend), PE anti-CD11c (clone N418, BioLegend), BV711 anti- souris CD3 (clone 17A2, BioLegend), BV421 anti-CD8α (clone 53-6.7, BioLegend) et Alexa Fluor 647 anti-FITC (Jackson ImmunoResearch) et ont été analysés sur un cytomètre en flux BD LSRFortessa.

Tous les travaux sur les animaux ont été menés dans le cadre d'une division de soins aux animaux de l'institut de médecine comparée du MIT, ont utilisé un protocole animal approuvé par le comité de protection des animaux du MIT et ont utilisé un protocole approuvé par le comité conformément aux directives fédérales, étatiques et locales.

Des souris C57BL/6 WT, CD45.1+, Batf3 knock-out (KO) et Rag1 KO (Jackson Laboratory, âgées de 6 à 8 semaines) ont été inoculées avec 106 B16F10, 106 MC38 ou 3 × 106 CT-2A cellules tumorales sc au flanc . Une fois que les tumeurs ont atteint une superficie d'environ 25 mm2, les souris ont subi une dose non myéloablative de 5 Gy de TBI administrée par une source de rayonnement gamma [137Cs], 24 h avant le transfert adoptif de 107 cellules CD45.1 + CAR T par voie intraveineuse (iv) via la veine caudale. Un jour plus tard, les souris ont été vaccinées en sc à la base de la queue avec 10 nmol de DSPE-PEG2k-FITC (Creative PEGworks) et 25 µg de di-GMP cyclique (Invivogen), et vaccinées pour trois doses totales, une fois par semaine. L'injection (it) de 10 nmol d'amph-FITC a été administrée en commençant le lendemain de la première vaccination, et en continuant tous les 3 jours.

Pour les études de xénogreffe, des souris NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) âgées de 6 à 12 semaines (Jackson Laboratory) ont été inoculées avec 3 × 106 cellules MSTO-211H sc au niveau du flanc. Une fois que les tumeurs ont atteint environ 25 mm2, les souris ont été transférées de manière adoptive avec 107 cellules CAR T iv via la veine caudale. L'injection (it) de 10 nmol d'amph-FITC a été administrée en commençant le lendemain du transfert adoptif et en continuant tous les 3 jours.

Pour toutes les études, la progression tumorale a été suivie par des mesures au pied à coulisse. La survie a été évaluée au fil du temps jusqu'à ce que les tumeurs dépassent 200 mm2 de surface, soient gravement ulcérées > 1 semaine ou subissent une perte de poids > 20 %. Pour surveiller le trafic des cellules CAR T exprimant FLuc, des souris ont reçu une injection sc au niveau de la peau de 150 mg kg -1 de sel de d-luciférine K + (Perkin-Elmer) et ont été imagées sur un Xenogen IVIS Spectrum. Avant l'imagerie, les souris C57BL/6 ont été épilées sur le dos pour améliorer la sensibilité au signal.

Pour la quantification des CAR T murins et des cellules T endogènes dans le sang périphérique, la tumeur et la rate, les tissus ont été homogénéisés à travers un tamis cellulaire de 70 µm (à l'exception des tumeurs MC38, qui ont nécessité une digestion enzymatique comme décrit ci-dessus). Des échantillons de sang et de rate ont été incubés avec un tampon de lyse ACK (Gibco) pour isoler les cellules mononucléaires et les splénocytes du sang périphérique, respectivement. Les échantillons ont ensuite été colorés avec PE anti-CD45.1 (clone A20, BioLegend), BUV805 anti-CD8α (clone 53-6.7, BioLegend), Alexa Fluor 647 anti-CD4 (clone GK1.5, BioLegend), APC-Cy7 anti -CD45.2 (clone 104, BioLegend) et LIVE/DEAD Fixable Aqua (ThermoFisher) et analysés sur un cytomètre en flux BD LSRFortessa.

Pour les études d'absorption d'antigène, les tumeurs et les LN ont été colorés avec le kit de viabilité fixable Zombie Aqua (BioLegend), BUV395 anti-CD45 (clone 30-F11, BD Biosciences), BV421 anti-CD103 (clone 2E7, BioLegend), BV605 anti-Ly6C ( clone HK1.4, BioLegend), BV711 anti-F4/80 (clone BMB, BioLegend), BV785 anti-CD11b (clone M1/70, BioLegend), Alexa Fluor 700 anti-CD86 (clone GL1, BioLegend), PE-Cy7 anti-IA/IE (clone M5/114.15.2, BioLegend), APC anti-CD24 (clone 30-F1, BioLegend), APC-Cy7 anti-CD11c (clone N418, BioLegend), PE-Cy5 anti-CCR7 (clone 4B12, BioLegend), PerCP-Cy5.5 anti-CD169 (clone 3D6.112, BioLegend) et BUV737 anti-CD8α (clone 53-6.7, BD Biosciences).

Pour la quantification des cellules CAR T humaines dans le sang périphérique, la rate et la tumeur, les tissus ont été traités comme décrit ci-dessus, puis colorés avec LIVE/DEAD Aqua, BUV496 anti-CD4 (clone SK3/Leu3a, BD Biosciences), BUV805 anti-CD8α ( clone SK1, BD Biosciences), PE anti-myc tag (clone 9B11, Cell Signaling) et APC-Cy7 anti-CD45 (clone 2D1, BioLegend).

Les rates ont été traitées comme décrit ci-dessus. Les cellules cibles CT-2A et B16F10 ont été prétraitées avec 100 U ml-1 et 500 U ml-1 d'IFN-γ murin (Abcam), respectivement pendant 16 h, puis irradiées à 120 Gy avec une source de rayonnement gamma [137Cs]. Les splénocytes (plusieurs dilutions à partir de 106 cellules par puits) ont été co-cultivés avec 25 000 cellules cibles par puits pendant 16 h, et ELISPOT a été réalisé à l'aide d'un ensemble ELISPOT IFN-γ de souris (BD Biosciences) conformément aux instructions du fabricant.

Les tissus (tumeur, poumons, foie et rein) ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant 24 h à 4 °C. Pour les études d'immunofluorescence, les tumeurs ont été incluses dans de l'agarose à basse température de gélification à 3 % (Sigma-Aldrich) avant d'être traitées en sections de 100 µm sur un vibratome Leica VT1000S. Des coupes de tissus ont été perméabilisées avec 2 % d'albumine de sérum bovin et 0,2 % de Triton-X 100 dans du PBS pendant 1 h à 37 °C avant coloration avec Alexa Fluor 647 ou DyLight 405 anti-FITC conjugué (Jackson ImmunoResearch) pendant 16 h à 37 °C, suivi de plusieurs lavages au PBS. La microscopie confocale a été réalisée sur un microscope confocal à balayage laser Olympus FV1200. Pour l'immunohistochimie de la distribution tumorale amph-FITC, des échantillons fixés au paraformaldéhyde ont été inclus dans la paraffine et des sections de 10 µm ont été obtenues. Les coupes ont été colorées avec une étiquette anti-myc (9B11, Cell Signaling) ou anti-CD45.1 (A20, BioLegend). Pour les études d'immunohistochimie, les tumeurs ont été congelées dans un composé à température de coupe optimale et transformées en sections de 14 μm d'épaisseur sur un cryostat Leica CM1950. Des coupes de tissus ont été perméabilisées avec 2 % d'albumine de sérum bovin et 0,2 % de Triton-X 100 dans du PBS pendant 2 h à température ambiante avant d'être colorées avec de l'anti-Trp1 biotinylé (TA99) (don du Dr Dane Wittrup au MIT), de la streptavidine conjuguée au BV421 ( Biolegend), anti-FITC conjugué à Alexa Fluor 647 (clone SPM395, Novus Biologicals) et CellMask Orange Plasma Membrane Stain (Invitrogen). L'imagerie a été réalisée sur un microscope confocal spectral Leica SP8.

Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism 9. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart type (sd). Pour évaluer la signification statistique, les tests suivants ont été utilisés : entre deux groupes, test t de Student bilatéral non apparié ou test U de Mann-Whitney ; pour les comparaisons multiples, analyse de variance bidirectionnelle (ANOVA) avec les comparaisons multiples de Tukey ; pour des mesures répétées sur une durée, ANOVA à deux facteurs avec mesures répétées ; pour les courbes de survie de Kaplan-Meier, test du log-rank (Mantel-Cox). Toutes les valeurs P sont fournies dans les figures ou dans leurs légendes.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les principales données à l'appui des résultats de cette étude sont disponibles dans le document et ses informations supplémentaires. Toutes les données à l'appui des conclusions de cette étude sont également disponibles auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions le Koch Institute Swanson Biotechnology Center pour son soutien technique, en particulier les installations de base d'imagerie et de tests précliniques, de cytométrie en flux, de microscopie et d'histologie. Les figures 1a, 3a, 6a et 7b ont été créées avec Biorender.com. AQZ a été soutenu par le numéro de prix T32GM007753 de l'Institut national des sciences médicales générales. Ce travail a été soutenu en partie par le Marble Center for Cancer Nanomedicine, le NIH (prix CA247632), la Mark Foundation for Cancer Research, le Ragon Institute of MGH, MIT et Harvard, et le Koch Institute Support (core) Grant P30-CA14051 de l'Institut national du cancer. DJI est un chercheur du Howard Hughes Medical Institute.

Institut Koch pour la recherche intégrative sur le cancer, Cambridge, MA, États-Unis

Angela Q. Zhang, Alexander Hostetler, Laura E. Chen, Vainavi Mukkamala, Wuhbet Abraham, Lucia T. Padilla, Alexandra N. Wolff, Laura Maiorino, Coralie M. Backlund, Aereas Aung, Mariane Melo, Na Li, Shengwei Wu & Darrell J.Irvine

Département des sciences et technologies de la santé, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, États-Unis

Angela Q. Zhang

Département de biophysique, Université Harvard, Cambridge, MA, États-Unis

Angela Q. Zhang

Département de génie biologique, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, États-Unis

Alexander Hostetler, Laura E. Chen, Vainavi Mukkamala, Lucia T. Padilla, Alexandra N. Wolff et Darrell J. Irvine

Ragon Institute of MIT, MGH et Harvard, Cambridge, MA, États-Unis

Darrell J.Irvine

Institut médical Howard Hughes, Chevy Chase, MD, États-Unis

Darrell J.Irvine

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DJI et AQZ ont conçu le concept it amph-ligand et rédigé l'article. AQZ, AH, LEC, VM et DJI ont conçu des expériences. AQZ, AH, LEC, VM, WA, LTP et ANW ont réalisé des expériences in vitro de marquage amph-FITC et de co-culture. AQZ, AH, LEC, LM et CMB ont réalisé des expériences de marquage amph-FITC in vivo. AQZ, LEC, VM et WA ont réalisé des expériences de trafic de cellules CAR T in vivo. AQZ, LM, AH et AA ont réalisé des expériences d'histologie. AQZ, AH, LEC, VM, WA, LTP, ANW, LM, CMB, MM, NL et SW ont réalisé des études thérapeutiques in vivo dans des modèles syngéniques. AQZ et LTP ont réalisé des études thérapeutiques in vivo sur des modèles murins de xénogreffe humaine. AQZ, LEC et VM ont réalisé des expériences de propagation d'épitopes.

Correspondance à Darrell J. Irvine.

AQZ, AH, LEC et DJI ont déposé une demande de brevet déposée par le MIT concernant les données présentées dans ce travail. DJI est consultant et actionnaire d'Elicio Therapeutics, qui détient des droits de licence sur la propriété intellectuelle du MIT mentionnée ci-dessus. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt.

Nature Biomedical Engineering remercie Stephen Gottschalk, Donald O'Rourke et Masataka Suzuki pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a Chronologie du traitement chez les souris C57BL/6 porteuses de tumeurs MC38. b, c Cellules CAR T dans le sang périphérique (b, jour 4) et la tumeur (c, jour 11) (n = 5 animaux/groupe). Les valeurs de p ont été déterminées par le test t de Student non apparié. Les barres d'erreur représentent l'écart type. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Données source

a Des groupes de souris C57BL/6 porteuses de tumeurs B16F10 (n = 5 animaux/groupe) ont été lymphodéplétées avec 250 mg/kg de cyclophosphamide et 50 mg/kg de fludarabine administrés un jour avant le transfert de cellules adoptives, suivi d'un traitement avec de l'amph-FITC intratumoral et de l'amph -Rappel du vaccin FITC comme indiqué. b Comparaison de la croissance tumorale chez les souris non traitées (n = 7) par rapport aux animaux recevant un régime lymphodéplétif de 5 Gy TBI (n = 8) sept jours après avoir été inoculés avec 3 × 106 cellules CT-2A. Les valeurs de p ont été déterminées par ANOVA à deux facteurs. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne. ns, non significatif ; **p < 0,01.

Données source

a Comparaison de la croissance tumorale (à gauche) et de la survie (à droite) chez des souris porteuses de tumeur CT-2A traitées avec des cellules CAR T suivies d'un amph-FITC intratumoral tous les 3 ou 6 jours (n = 5 animaux/groupe). b Comparaison de la croissance tumorale (à gauche) et de la survie (à droite) chez des souris porteuses de tumeur CT-2A traitées avec des cellules FITC CAR T préparées dans mIL-2 ou une combinaison de mIL-7 et mIL-15 (n = 5 animaux/groupe ). Les valeurs P ont été déterminées par ANOVA à deux voies (courbes de croissance tumorale) et test du log-rank (Mantel-Cox) (courbes de survie). Les barres d'erreur représentent l'écart type. ns, non significatif ; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Données source

a Chronologie du traitement chez les souris C57BL/6 porteuses de tumeurs CT-2A. b Poids corporel des souris C57BL/6 porteuses de tumeur B16F10 au cours du traitement (n = 5 animaux/groupe). c, d Quantification des cytokines sériques (c, n = 5 animaux/groupe) et ALT et AST sériques (d, n = 7 animaux/groupe) à 3 et 12 jours après le transfert adoptif. Les valeurs P ont été déterminées par ANOVA à deux voies (courbes de poids corporel) ou par le test t de Student non apparié. Les barres d'erreur représentent l'erreur type de la moyenne (b) et l'écart type (c). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Données source

a Cytotoxicité in vitro des cellules FITC CAR T avec des cellules cancéreuses de mésothéliome humain amph-FITC + MSTO-211H à un rapport ET de 1: 1. b Comparaison du signal de luciférase des cellules fLuc+ CAR T au fil du temps chez des souris traitées uniquement avec des cellules CD8+ 4m5.3-h28z CAR T ou une combinaison de cellules CD4+ et CD8+ CAR T (n = 5 animaux/groupe). c, d Stratégie de déclenchement pour l'immunophénotypage des cellules CAR T humaines ( c ) et composition phénotypique des cellules CAR T récupérées à partir de la rate de souris NSG 23 jours après le transfert adoptif (d, n = 5 animaux / groupe). e Quantification des cellules CD4+ et CD8+ CAR T dans la rate au jour 40 après le transfert adoptif (n = 5 animaux/groupe). f Éclat de la souris entière au fil du temps en tant que substitut de l'expansion des cellules CAR T (n = 5 animaux/groupe). Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne.

Données source

Fig. supplémentaires. 1–5.

Données sources pour tous les chiffres.

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Réimpressions et autorisations

Zhang, AQ, Hostetler, A., Chen, LE et al. Redirection universelle des cellules CAR T contre les tumeurs solides via des ligands insérés dans la membrane pour le CAR. Nat. Biomédical. Eng (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-023-01048-8

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Reçu : 19 avril 2022

Accepté : 01 mai 2023

Publié: 08 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41551-023-01048-8

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