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Aug 11, 2023

Le HDGF favorise la résistance au géfitinib en activant les voies de signalisation PI3K/AKT et MEK/ERK chez les non

Dec 22, 2023

Cell Death Discovery volume 9, Numéro d'article : 181 (2023) Citer cet article

Détails des métriques

L'expression du facteur de croissance dérivé de l'hépatome (HDGF) est associée à un mauvais pronostic dans le cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC); cependant, si HDGF affecte la résistance au gefitinib dans le NSCLC reste inconnue. Cette étude visait à explorer le rôle du HDGF dans la résistance au gefitinib dans le NSCLC et à découvrir les mécanismes sous-jacents. Des lignées cellulaires stables d'inactivation ou de surexpression de HDGF ont été générées pour effectuer des expériences in vitro et in vivo. Les concentrations de HDGF ont été déterminées à l'aide d'un kit ELISA. La surexpression de HDGF a exacerbé le phénotype malin des cellules NSCLC, tandis que l'inactivation de HDGF a exercé les effets opposés. De plus, les cellules PC-9, qui étaient initialement sensibles au géfitinib, sont devenues résistantes au traitement au géfitinib après la surexpression de HDGF, tandis que l'inactivation de HDGF a amélioré la sensibilité au géfitinib dans les cellules H1975, qui étaient initialement résistantes au géfitinib. Des niveaux plus élevés de HDGF dans le plasma ou le tissu tumoral ont également indiqué une résistance au géfitinib. Les effets du HDGF sur la promotion de la résistance au gefitinib ont été largement atténués par MK2206 (inhibiteur d'Akt) ou U0126 (inhibiteur d'ERK). Mécaniquement, le traitement au gefitinib a provoqué l'expression du HDGF et activé les voies Akt et ERK, qui étaient indépendantes de la phosphorylation de l'EGFR. En résumé, HDGF contribue à la résistance au gefitinib en activant les voies de signalisation Akt et ERK. Les niveaux plus élevés de HDGF peuvent prédire une faible efficacité du traitement TKI, il a donc le potentiel de servir de nouvelle cible pour surmonter la résistance aux inhibiteurs de la tyrosine kinase dans la lutte contre le NSCLC.

Le cancer du poumon est la cause la plus fréquente de décès liés au cancer dans le monde. Le cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC) représente environ 80 % de tous les cas de carcinome pulmonaire. Les patients porteurs de mutations du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) répondent bien aux inhibiteurs de la tyrosine kinase (ITK), mais tous les patients répondeurs finissent par développer une résistance acquise aux ITK [1]. Les mécanismes sous-jacents de la résistance aux TKI comprennent des mutations de résistance secondaires des gènes ciblés, l'activation des voies de signalisation de dérivation, la dérégulation des effecteurs en aval et la transformation phénotypique [2]. La mutation T790M dans l'exon 20 de l'EGFR représente environ 50 % des cas résistants et constitue le mécanisme de résistance prédominant des ITK. Cependant, environ 19 % des mécanismes de résistance restent inconnus [3].

Le facteur de croissance dérivé de l'hépatome (HDGF) est un facteur de croissance liant l'héparine qui a été identifié pour la première fois à partir du milieu conditionné de la lignée cellulaire d'hépatome Huh-7 [4], indiquant qu'il peut être sécrété. Il a été rapporté que le HDGF est impliqué dans la croissance des cellules cancéreuses, l'angiogenèse, l'anti-apoptose et les métastases tumorales [4, 5]. Dans une gamme de types de tumeurs, y compris le NSCLC, le cancer de l'ovaire, le cancer de la bouche, le cancer gastrique et le mélanome, le HDGF est surexprimé et son expression plus élevée est fortement corrélée à un mauvais pronostic [6,7,8,9,10,11]. Le HDGF améliore l'angiogenèse dépendante du facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF) dans le NSCLC [12], et des taux sériques élevés de HDGF prédisent des métastases osseuses et un pronostic défavorable dans le NSCLC [13]. Dans le CBNPC de stade I réséqué chirurgicalement, HDGF est considéré comme un biomarqueur pour la stadification moléculaire et le pronostic et fournit une prédiction pour la chimiothérapie adjuvante postopératoire [14]. L'inhibition du HDGF a supprimé la croissance des cellules tumorales à la fois in vitro et in vivo [15, 16]. Les anticorps ciblant HDGF pourraient prévenir la rechute du NSCLC après la chimiothérapie en supprimant les cellules souches cancéreuses [17, 18]. Certains microARN (miARN) inhibent la prolifération et l'invasion du NSCLC en ciblant le HDGF [19,20,21]. Ainsi, le HDGF est une cible potentielle prometteuse pour le traitement du NSCLC.

Notre expérience précédente a démontré que l'extrait de Marsdenia tenacissima (MTE) pouvait surmonter la résistance au gefitinib, un TKI de première génération largement utilisé, dans le NSCLC in vitro et in vivo [22, 23]. Pendant ce temps, MTE pourrait perturber l'interaction entre les macrophages associés à la tumeur et les cellules NSCLC en ciblant HDGF [24]. Notre étude préliminaire a montré que le MTE combiné au gefitinib pouvait diminuer l'expression du HDGF dans les cellules H1975 résistantes, comme en témoigne l'électrophorèse sur gel 2D couplée à la chromatographie liquide haute performance-spectrométrie de masse en tandem (HPLC‒MS/MS) et le Western blot (Fig. S1 ). Des études ont indiqué que le HDGF favorise la résistance à la chimiothérapie dans les cellules cancéreuses colorectales et le carcinome épidermoïde de la langue [25, 26], et qu'il entraîne la radiorésistance dans le cancer du sein [27]. Cependant, le rôle du HDGF dans la résistance au géfitinib n'est pas clair. Bien que les rapporteurs peptidiques spécifiques au site et la spectrométrie de masse ciblée aient indiqué que HDGF-S165, un peptide substrat synthétique, puisse avoir une association potentielle avec la résistance aux TKI [28], il n'y a aucune preuve directe associant les niveaux de HDGF et l'efficacité des TKI. Dans cette étude, nous avons démontré la corrélation entre HDGF et la résistance au gefitinib in vitro et in vivo et identifié l'effet complémentaire entre HDGF et EGFR dans les cellules NSCLC.

Grâce à des analyses sur gel 2D et LC‒MS/MS, le HDGF a été identifié comme l'une des protéines exprimées de manière différentielle dans les cellules H1975 traitées avec du gefitinib ou du MTE seul ou en combinaison (Fig. S1). Des études ont indiqué que l'expression de HDGF est considérée comme un facteur pronostique chez les patients atteints d'un CBNPC à un stade précoce [6] ; Le HDGF favorise également la résistance à la chimiothérapie dans certaines tumeurs, notamment le cancer colorectal, le cancer des cellules squameuses de la langue et le cancer du sein [25,26,27]. Par conséquent, nous avons choisi HDGF comme protéine cible pour une étude plus approfondie. Les résultats du Western blot ont montré que le HDGF était significativement régulé à la baisse après une exposition au traitement combiné au gefitinib et au MTE par rapport à chaque traitement unique et au groupe témoin dans les cellules H1975 (Fig. S1).

Pour mieux comprendre la fonction de HDGF dans le NSCLC, nous avons détecté son expression dans sept lignées cellulaires NSCLC avec différentes réponses au gefitinib. Les cellules PC-9 et H292 sensibles au géfitinib avaient une expression de HDGF relativement plus faible, tandis que les cellules H1975 exprimaient des niveaux très élevés de HDGF (Fig. S1). Le HDGF a été renversé par le système CRISPR/Cas9 dans les cellules H1975, tandis que la surexpression stable du HDGF a été établie en transfectant le plasmide HDGF plenti6-TR dans les cellules PC-9 et H292. La surexpression ou l'inactivation du HDGF a été validée par Western blot et qRT‒PCR (Figs. 1A, 1B).

Le HDGF a été renversé par le système CRISPR/Cas9 dans les cellules H1975, alors qu'il était surexprimé dans les cellules PC-9 et H292 en transfectant le plasmide plenti6-TR. L'expression du HDGF a été détectée par Western blot (A) et qRT‒PCR. B La prolifération de cellules NSCLC avec différents niveaux d'expression de HDGF (C) ou stimulées avec 5 ng de rhHDGF (D) a été détectée à 24, 48, 72 et 96 h. E Capacités de formation de colonies de cellules NSCLC avec différents niveaux d'expression de HDGF. F montre les résultats analytiques de E. G. Les capacités de migration et d'invasion des cellules HDGF-knockdown H1975 ont été déterminées par le test de Transwell. H Affiche les résultats analytiques de (G). I Les capacités de migration et d'invasion ont été déterminées dans les cellules PC-9 et H292 surexprimant le HDGF. J montre les résultats analytiques de (I). Les données proviennent d'une expérience représentative réalisée en triple exemplaire. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,005 par rapport au contrôle.

Pour comprendre l'influence des niveaux de HDGF sur les caractéristiques biologiques des cellules NSCLC, nous avons mesuré les phénotypes cellulaires après knockdown ou surexpression de HDGF. Comme le montre la Fig. 1, HDGF sgRNA1 et sgRNA2 ont inhibé de manière significative H1975 la prolifération cellulaire (Fig. 1C), la formation de colonies (Fig. 1E, F) et les capacités de migration et d'invasion (Fig. 1G, H) (P <0, 01, P < 0,001 vs contrôle), indiquant que l'inactivation du HDGF réduisait les propriétés malignes des cellules NSCLC. En revanche, la prolifération des cellules H292 et PC-9 a été favorisée par la surexpression de HDGF (Fig. 1C) ou stimulée avec rhHDGF (Fig. 1D). Pendant ce temps, la surexpression de HDGF a amplifié les capacités de formation de colonies (Fig. 1E, F) et de migration et d'invasion (Fig. 1I, J) des cellules H292 et PC-9 (P <0, 01, P <0, 001 par rapport au contrôle). Par conséquent, les données ci-dessus ont démontré que le HDGF favorisait le phénotype malin des cellules NSCLC.

Nous avons déterminé l'association entre le HDGF et la croissance tumorale chez les souris xénogreffes. Comme le montre la Fig. 2, par rapport au groupe témoin, la croissance tumorale a été significativement réduite par les deux sgRNA de HDGF (Fig. 2A – C), et l'effet inhibiteur était plus évident dans le groupe sgRNA2, indiquant que l'inactivation de HDGF limitait le développement de la tumeur H1975. . Pendant ce temps, le Western blot a confirmé que l'expression de HDGF était inhibée par les deux ARNsg dans les tissus tumoraux H1975 (Fig. 2D, E). Inversement, la surexpression de HDGF a nettement augmenté le volume et le poids de la tumeur PC-9 par rapport au groupe témoin (Fig. 2F – H). Les tests Western blot ont également confirmé des niveaux plus élevés de HDGF dans les tissus tumoraux PC-9 (Fig. 2I, J). Les résultats ci-dessus ont indiqué que le HDGF favorisait la croissance tumorale mais que l'inactivation du HDGF pouvait limiter ce processus.

A Images représentatives des tumeurs de xénogreffe H1975 avec knockdown HDGF. B, C montrent le volume et le poids de la tumeur de la xénogreffe H1975. D Expression de la protéine HDGF dans les tissus tumoraux de souris H1975. E Affiche les résultats analytiques de (D). F Images représentatives de tumeurs de xénogreffe PC-9 chez des souris nude avec surexpression de HDGF. G, H Afficher le volume et le poids de la tumeur de la xénogreffe PC-9. I Expression de la protéine HDGF dans les tissus tumoraux de souris PC-9. J montre les résultats analytiques de I. L'expression de p-Akt et p-ERK dans les cellules H1975 et PC-9 (K) ou les tissus tumoraux de souris (L) avec knockdown ou surexpression de HDGF. M, N Montrer les résultats analytiques de (K, L). La surexpression de O, P HDGF ou la croissance des cellules H292 et PC-9 induite par le rhHDGF a été abrogée ou inversée par l'inhibiteur Akt MK2206 ou l'inhibiteur ERK1/2 U0126. Les données proviennent d'une expérience représentative réalisée en triple exemplaire. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,005 par rapport au contrôle.

Des études ont démontré que les molécules en aval de l'EGFR p-Akt et p-ERK sont anormalement activées lorsque le NSCLC exerce une résistance au gefitinib [29]. Dans notre expérience, les altérations de ces deux molécules ont été déterminées dans les cellules NSCLC et les tissus tumoraux de souris. Comparé au groupe témoin, l'inactivation de HDGF a entraîné une diminution spectaculaire de l'expression de p-Akt et de p-ERK dans les cellules H1975, et le sgRNA2 a montré un effet inhibiteur plus puissant. En revanche, la surexpression de HDGF a augmenté les niveaux de p-Akt et p-ERK dans les cellules H292 et PC-9 (Fig. 2K, M). Dans les tissus tumoraux de souris, les changements de p-Akt et p-ERK étaient cohérents avec ceux des lignées cellulaires (Fig. 2L, N). En présence de l'inhibiteur Akt MK2206 ou de l'inhibiteur ERK U0126, la croissance accrue induite par la surexpression de HDGF ou rhHDGF dans les cellules H292 et PC-9 a été abrogée ou inversée (Fig. 2O, P).

Après avoir compris le rôle du HDGF dans le NSCLC, nous avons étudié plus avant l'association entre l'expression du HDGF et l'efficacité du gefitinib. Comme le montre la figure 3A, l'inactivation du HDGF par les ARNsg dans les cellules H1975 a bien répondu au géfitinib, avec des valeurs IC50 de 2, 21 μM et 1, 08 μM, respectivement, contre 7, 30 μM dans le groupe témoin ARNsg. En revanche, HDGF a augmenté les valeurs IC50 du gefitinib de 17 et 20 fois par rapport aux cellules parentales H292 et PC-9 sensibles au gefitinib (Fig. 3B, C). Le traitement au géfitinib a nettement supprimé la formation de colonies et les capacités de migration et d'invasion dans les cellules H1975 réduites au silence par HDGF, mais n'a exercé que des influences mineures dans le groupe témoin (Fig. 3D, G, J, M). À l'inverse, le traitement au géfitinib a réduit la formation de colonies (Fig. 3E, F, H, I) et les capacités de migration et d'invasion (Fig. 3K, L, N, O) des cellules H292 et PC-9, mais ces effets inhibiteurs ont été abrogés après Surexpression du HDGF. Les résultats ci-dessus suggèrent qu'une expression plus élevée de HDGF peut être associée à une résistance au géfitinib.

Les cellules A – C H1975, PC-9 et H292 ont été traitées avec 0, 001 ~ 50 μM de gefitinib pendant 72 h. La capacité de formation de colonies de cellules D – F NSCLC a été détectée après le traitement au gefitinib. G–I Montrer les résultats analytiques de D–F. Les capacités de migration et d'invasion des cellules J – L NSCLC ont été détectées après un traitement au gefitinib pendant 24 h. M–O Montrer les résultats analytiques de JL. Les données proviennent d'une expérience représentative réalisée en triple exemplaire. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,005 par rapport au contrôle.

Pour évaluer la corrélation entre HDGF et l'efficacité du gefitinib in vivo, nous avons mené des expériences chez des souris implantées avec des cellules NSCLC avec knockdown ou surexpression de HDGF. Comme le montre la Fig. 4A – C, un traitement au gefitinib à 50 mg/kg n'a pas entraîné d'effet antitumoral évident dans les xénogreffes H1975. Cependant, il a provoqué un rétrécissement significatif de la tumeur dans le groupe HDGF sgRNA2, ce qui suggère que l'inactivation du HDGF améliorait la sensibilité au géfitinib. Inversement, dans les xénogreffes PC-9 sensibles au géfitinib, l'expression stable du HDGF a entraîné une croissance tumorale rapide par rapport au groupe témoin, mais l'effet promoteur de la tumeur du HDGF a été atténué par l'administration de 10 mg / kg de géfitinib (Fig. 4D – F). Cependant, une régression tumorale s'est produite à la fois dans les groupes de surexpression et de contrôle de HDGF, ce qui peut être dû à la dose relativement élevée de gefitinib utilisée dans cette expérience car les cellules PC-9 sont très sensibles au gefitinib. Néanmoins, la surexpression de HDGF entraînait toujours une croissance tumorale plus rapide que celle observée dans le groupe témoin après le traitement au géfitinib (P <0, 05), ce qui implique que l'augmentation de HDGF a abrogé l'efficacité du géfitinib dans une certaine mesure. Comme le montre la figure 4G, l'expression de Ki-67 et de HDGF dans les tissus tumoraux de souris présentait des schémas similaires en termes de volume et de poids de la tumeur dans les xénogreffes H1975 et PC-9.

Des cellules NSCLC ont été inoculées par voie sous-cutanée chez des souris nude, qui ont ensuite reçu du gefitinib pendant les jours consécutifs indiqués après la formation de la tumeur. Volume tumoral, images représentatives des tumeurs et poids tumoral des xénogreffes HDGF-knockdown H1975 traitées avec 50 mg/kg de gefitinib (A–C) ou des xénogreffes PC-9 surexprimant HDGF traitées avec 10 mg/kg de gefitinib (D–F). Niveaux d'expression de G HDGF et Ki-67 dans les tissus tumoraux H1975 et PC-9 (20 ×). H, I Concentrations plasmatiques de HDGF dans les xénogreffes H1975 et PC-9. J, K Concentrations plasmatiques de HDGF chez les patients atteints de NSCLC avant de recevoir du gefitinib ou de l'AZD9291 (un TKI de troisième génération) et après l'apparition d'une résistance aux médicaments. L, M Taux plasmatiques de HDGF chez chaque patient avant et après avoir reçu du géfitinib ou de l'AZD9291. Expression de N HDGF dans des échantillons de tissus de biopsie mesurée par IHC avant le traitement TKI et après la progression de la maladie. Le patient n° 1 a reçu un traitement à l'icotinib et le patient n° 2 a reçu de l'AZD9291. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs contrôle.

Étant donné que HDGF est une protéine sécrétoire, nous avons détecté ses concentrations dans le plasma de souris porteuses de tumeurs NSCLC pour déterminer si les taux plasmatiques de HDGF sont pertinents pour l'efficacité du géfitinib. Comme le montre la figure 4H, I, la concentration de HDGF plasmatique de souris était parallèle à l'efficacité du géfitinib. Nous avons également analysé de manière préliminaire les concentrations plasmatiques de HDGF chez huit patients atteints de NSCLC avant et après la prise de gefitinib en monothérapie. Comme le montre la figure 4J, K, par rapport à la ligne de base, chacun des cas et leurs taux plasmatiques moyens de HDGF sont devenus manifestement élevés lorsque la résistance aux médicaments s'est produite. De plus, nous avons mesuré les concentrations plasmatiques de HDGF chez cinq patients atteints de NSCLC avant et après avoir reçu AZD9291, un ITK de troisième génération, jusqu'à ce qu'ils développent une résistance aux médicaments. Les résultats étaient similaires à ceux observés chez les patients atteints de NSCLC avec une résistance acquise au gefitinib (Fig. 4L, M). L'expression de HDGF a été détectée dans des échantillons de biopsie appariés avant et après le traitement par TKI. Ce qui est excitant, c'est que le HDGF était fortement exprimé dans les deux cas où la résistance aux TKI s'est produite, ce qui suggère que des niveaux plus élevés de HDGF peuvent prédire une faible efficacité du traitement par les TKI. Néanmoins, seuls des échantillons limités ont été testés dans la présente étude, et davantage d'échantillons cliniques sont nécessaires pour vérifier ce résultat.

Pour explorer les mécanismes de la résistance au gefitinib induite par HDGF, nous avons déterminé les protéines p-Akt et p-ERK associées à la résistance au gefitinib dans les cellules NSCLC (Fig. 5A) et les tissus tumoraux de souris (Fig. 5B). L'inactivation de HDGF a notamment réduit l'expression de p-Akt et p-ERK, et cet effet a été encore renforcé par le gefitinib, qui à lui seul a augmenté la phosphorylation d'Akt et ERK dans les cellules H975. En revanche, bien que le géfitinib ait inhibé de manière proéminente p-Akt et p-ERK dans les cellules H292 et PC-9, il n'a pas pu inverser la phosphorylation accrue de Akt et ERK causée par la surexpression de HDGF. Les données ci-dessus ont en outre confirmé que les niveaux de HDGF étaient associés à la signalisation liée à la résistance au géfitinib.

L'expression de p-Akt et p-ERK dans les cellules NSCLC (A) ou les tissus tumoraux de xénogreffe (B) avec silençage ou surexpression du HDGF après traitement au géfitinib. C Viabilité cellulaire des cellules PC-9 traitées avec 1 µM de gefitinib pendant 24 h en présence de rhHDGF, MK2206 (inhibiteur Akt, 0,5 µM) ou U0126 (inhibiteur ERK1/2, 5 µM). D Le plasmide de mutation pcDNA3.1-EGFR T790M et le vecteur de surexpression HDGF seuls ou ensemble ont été introduits dans la cellule PC-9, puis traités avec du gefitinib pendant 72 h. Les données proviennent d'une expérience représentative réalisée en triple exemplaire. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs contrôle.

Des résultats antérieurs ont montré que la croissance cellulaire induite par HDGF était abrogée ou inversée par des inhibiteurs de la voie Akt ou ERK. Sur la figure 5C, nous avons ajouté MK2206 (un inhibiteur d'Akt) ou U0126 (un inhibiteur de ERK) pour valider si HDGF favorise la résistance au gefitinib via ces deux voies de signalisation. Les résultats ont montré que le traitement par HDGF diminuait effectivement la sensibilité des cellules PC-9 au gefitinib ; cependant, les effets stimulants de HDGF sur la résistance au géfitinib ont été largement atténués par MK2206 ou U0126, ce qui suggère que HDGF peut induire une résistance au géfitinib via la voie de signal Akt et ERK.

La mutation EGFR T790M est le principal mécanisme de résistance au géfitinib. Pour déterminer si HDGF est impliqué dans la résistance au gefitinib médiée par T790M, le plasmide de mutation pcDNA3.1-EGFR T790M et le vecteur de surexpression HDGF seuls ou ensemble ont été introduits dans les cellules PC-9. Sur la figure 5D, nos résultats ont montré que la mutation T790M ou la surexpression de HDGF seule entraînait une résistance au géfitinib avec des valeurs IC50 de 0, 107 µM et 0, 181 µM, respectivement. Plus important encore, lorsque les cellules PC-9 ont été soumises à la fois à la mutation T790M et à la surexpression de HDGF, la résistance au géfitinib (IC50 = 0,253 µM) a été renforcée davantage que dans les cellules avec une seule mutation T790M ou une surexpression de HDGF. Ces résultats suggèrent que la résistance au gefitinib causée par la mutation T790M ou la surexpression de HDGF peut ne pas partager un même mécanisme. Par conséquent, HDGF peut ne pas être impliqué dans la résistance au gefitinib initiée par la mutation T790M.

Nous avons constaté que le silence ou la surexpression de HDGF affectait l'activation de l'EGFR en aval de l'Akt et de l'ERK, qui est liée à la résistance aux TKI. Ensuite, nous avons demandé s'il existait une diaphonie entre HDGF et EGFR. Tout d'abord, nous avons recherché Pathcards dans la base de données GeneCards (http://www.genecards.org) et avons constaté sans surprise que la majorité des voies HDGF chevauchaient l'EGFR, y compris la signalisation Akt et ERK (Fig. 6A). Ensuite, nous avons constaté que les niveaux de p-EGFR étaient inversement corrélés à l'inactivation ou à la surexpression de HDGF dans les cellules NSCLC et les tissus tumoraux (Fig. 6B, C). Le géfitinib a inhibé le p-EGFR mais a amélioré le HDGF de manière dose-dépendante dans les cellules NSCLC testées, à l'exception des cellules H157, qui ont des niveaux d'expression extrêmement faibles du p-EGFR et du HDGF (Fig. 6D, E), ce qui indique que l'élévation du HDGF induite par le géfitinib ne s'est produite que dans l'EGFR- cellules NSCLC dépendantes. En parallèle, les concentrations de HDGF sécrétées dans les surnageants des cellules NSCLC testées, à l'exception des cellules H157, ont également été augmentées après le traitement au gefitinib (Fig. 6F).

A Les voies qui se chevauchent entre HDGF et EGFR ont été extraites de la base de données GeneCards. L'expression de l'EGFR a été détectée dans les cellules NSCLC (B) et les tumeurs de xénogreffe (C) avec knockdown ou surexpression de HDGF. Les niveaux d'expression de p-EGFR et de HDGF ont été déterminés dans des lignées cellulaires NSCLC (D) et des cellules NSCLC traitées au gefitinib pendant 24 h (E). Concentrations de F HDGF dans les surnageants de cellules NSCLC après traitement au gefitinib pendant 24 h. Modifications de l'expression de HDGF et de p-EGFR dans les cellules NSCLC traitées au gefitinib (G) et les tissus tumoraux de xénogreffe (H) avec knockdown et surexpression de HDGF. I, J Afficher les résultats analytiques de G, H. Les données proviennent d'une expérience représentative réalisée en triple exemplaire. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs contrôle.

Nous avons ensuite demandé si HDGF et EGFR avaient des rôles complémentaires dans la réponse au gefitinib dans les cellules NSCLC avec perte et gain de HDGF. Comme le montre la figure 6G, I, l'inactivation du HDGF a provoqué une diminution de l'expression du HDGF et la régulation à la hausse du p-EGFR a été inversée par le traitement au géfitinib dans les cellules H1975. Dans les cellules H292 et PC-9, la surexpression de HDGF a entraîné une élévation de HDGF et une suppression de p-EGFR, et le traitement au géfitinib a encore inhibé p-EGFR mais sans influence évidente sur l'expression de HDGF. Comme le montre la Fig. 6H, J, HDGF a été augmenté par l'administration de gefitinib dans des tumeurs de xénogreffe PC-9 avec surexpression de HDGF (P <0, 05), et d'autres modifications de HDGF et de p-EGFR dans les tissus tumoraux étaient cohérentes avec les expériences cellulaires. Par conséquent, les données ci-dessus indiquent une diaphonie entre l'HDGF et l'EGFR dans le NSCLC, et l'HDGF peut servir de molécule de signalisation de contournement de l'EGFR pour activer les molécules en aval Akt et ERK. De plus, HDGF et EGFR ont des rôles complémentaires dans le maintien de la survie des cellules tumorales exposées au gefitinib. La fonction de HDGF dans la résistance au géfitinib est illustrée par un schéma de la Fig. 7.

Diagramme schématique de la contribution du HDGF à la résistance au gefitinib en activant les molécules en aval de l'EGFR comme contournement dans le NSCLC.

Dans la présente étude, nous avons constaté que des niveaux plus élevés de HDGF sont non seulement associés au phénotype malin du NSCLC, mais peuvent également induire une résistance au géfitinib. La signalisation liée à la résistance TKI, telle que les voies PI3K/Akt et MEK/ERK, pourrait être activée par contournement par HDGF de manière indépendante de l'EGFR. De plus, la suppression du HDGF a augmenté l'efficacité du géfitinib dans les cellules NSCLC résistantes à la fois in vitro et in vivo, ce qui suggère que le HDGF est une cible potentielle pour surmonter la résistance au géfitinib.

Premièrement, notre étude a démontré que le HDGF favorisait la tumorigenèse du NSCLC et facilitait les métastases. Dans les cellules H292 et PC-9, qui ont des niveaux relativement faibles d'expression de HDGF, l'expression forcée de HDGF a augmenté la prolifération, la formation de colonies et les capacités de migration et d'invasion des cellules. Pendant ce temps, l'expression exogène du rhHDGF a amélioré la prolifération des cellules H292 et PC-9, confirmant le rôle du HDGF en tant que stimulateur de croissance. La fonction de tumorigenèse de HDGF a également été confirmée chez des souris xénogreffes PC-9 surexprimant HDGF. En revanche, le silence HDGF par CRISPR a inhibé le phénotype malin des cellules H1975 et retardé le développement tumoral in vivo. Des études ont montré que le ciblage de l'HDGF par des miARN ou des anticorps est efficace pour inhiber la croissance du NSCLC [16, 19,20,21] ou du carcinome épidermoïde du poumon [30]. Cependant, jusqu'à présent, la plupart des études sur HDGF se sont principalement concentrées sur son rôle tumorigène, alors qu'une attention limitée a été accordée à la détermination de sa fonction dans la résistance aux thérapies anticancéreuses. Comme indiqué, HDGF a participé au développement de la résistance aux médicaments chimiothérapeutiques dans le cancer colorectal [25] et le carcinome épidermoïde de la langue [26] ou a favorisé la radiorésistance dans le cancer du sein [27]. L'inhibition du HDGF avec le polyphénol (-)-épigallocatéchine-3-gallate (EGCG) du thé vert pourrait augmenter la réponse du NSCLC à la chimiothérapie [31].

Le géfitinib est un EGFR-TKI de première génération largement utilisé pour les patients atteints de NSCLC présentant des mutations sensibles à l'EGFR, mais l'inévitable résistance aux médicaments entrave ses avantages cliniques. Les principaux mécanismes responsables de la résistance aux TKI comprennent des altérations des cibles médicamenteuses, telles que T790M, qui représente la moitié de tous les cas de résistance acquise, tandis que l'activation de la signalisation de dérivation comprend 20 à 25 % de tous les cas [32]. Cependant, il existe encore environ 15 à 20 % de patients atteints de NSCLC chez qui aucun mécanisme de résistance acquise aux ITK n'a été identifié [29]. Nos résultats ont révélé que l'inactivation du HDGF pouvait augmenter la sensibilité au géfitinib, tandis que l'augmentation du HDGF abrogeait l'efficacité du géfitinib dans une certaine mesure dans le NSCLC. En détail, l'inactivation du HDGF a inhibé la croissance tumorale dans les cellules H1975 in vitro et in vivo, tandis que la surexpression du HDGF a retardé la réponse du géfitinib dans les cellules PC-9. La coloration immunohistochimique de Ki-67 et de HDGF dans des coupes de tissu tumoral de souris était cohérente avec les résultats ci-dessus. Par conséquent, nos données ont indiqué que l'expression de HDGF était corrélée à l'efficacité du gefitinib dans le NSCLC. Ces résultats ont été en partie étayés par une étude récente qui fournit des indices sur la résistance au HDGF-S165 et au TKI via des rapporteurs peptidiques spécifiques au site et une spectrométrie de masse ciblée au niveau du nanogramme dans les cellules [28].

Des taux sériques élevés de HDGF prédisaient des métastases osseuses et un pronostic défavorable dans le CBNPC [13]. Premièrement, nous avons trouvé une corrélation parallèle entre les taux plasmatiques de HDGF et l'effet antitumoral du gefitinib dans les xénogreffes NSCLC. Dans un petit nombre d'échantillons cliniques, les taux de HDGF étaient également élevés dans le sang périphérique de patients atteints de NSCLC qui prenaient du gefitinib et de l'AZD9291 après l'apparition d'une résistance aux médicaments. Pendant ce temps, la surexpression de HDFG était associée à la résistance au géfitinib dans les échantillons cliniques. Ainsi, le HDGF est impliqué dans la résistance au géfitinib, et les niveaux de HDGF dans les échantillons de plasma ou de tissus peuvent prédire l'efficacité du TKI dans une certaine mesure. Cependant, seuls des échantillons cliniques limités ont été testés dans la présente étude ; ainsi, davantage d'échantillons cliniques sont nécessaires pour vérifier ces résultats.

La signalisation PI3K/Akt et MAPK/ERK sont les principales voies en aval de l'EGFR conduisant à la prolifération cellulaire. Les ITK se lient au domaine tyrosine kinase de l'EGFR et bloquent la signalisation pilotée par l'EGFR en aval pour exercer leurs effets inhibiteurs de tumeur. La mutation EGFR T790M interfère avec l'interaction en augmentant son affinité avec l'ATP pour conférer une résistance au géfitinib [33]. Dans les conditions indépendantes de l'EGFR, la dérégulation d'autres récepteurs tyrosine kinases ou l'activation anormale des signaux en aval a une fonction compensatoire pour abroger l'inhibition de l'EGFR et entraîne une résistance aux TKI [3]. La voie de signalisation de dérivation partage les mêmes voies en aval avec l'EGFR et converge pour déclencher les axes de signalisation PI3K/Akt et MAPK/ERK [30, 34]. Un grand nombre d'études ont démontré une activation aberrante de p-Akt et p-ERK en cas de résistance à l'EGFR-TKI [29], mais la restriction de l'expression de p-Akt et p-ERK pourrait restaurer la sensibilité du gefitinib dans le NSCLC [35, 36]. Dans la présente étude, l'inactivation de HDGF a inhibé la phosphorylation d'Akt et de ERK, tandis que la surexpression de HDGF a exercé l'effet inverse, suggérant qu'elle régule l'activation de p-Akt et p-ERK. Dans les cellules NSCLC sensibles au gefitinib, les niveaux de p-Akt et de p-ERK restreints au gefitinib ont été abrogés par la surexpression de HDGF ; cependant, dans les cellules H1975 résistantes, l'activation de Akt et ERK a été fortement supprimée par l'épuisement de HDGF. Des inhibiteurs d'Akt ou d'ERK ont été utilisés pour valider si HDGF induisait la croissance cellulaire et la résistance au gefitinib par ces deux voies. Ces données ont indiqué que le HDGF pourrait améliorer la signalisation p-Akt et p-ERK en aval de l'EGFR, qui est liée à la résistance au géfitinib.

Comme EGFR et HDGF régulent l'activation d'Akt et ERK, nous n'avons pas été surpris de constater que la majorité des voies connues de HDGF se chevauchaient avec EGFR, y compris la signalisation Akt et ERK, en recherchant GeneCards (https://www.genecards.org ). Ceci est cohérent avec une étude sur les cellules cancéreuses de l'ovaire dans laquelle le HDGF extracellulaire a stimulé la phosphorylation de ERK [37] et a favorisé le développement et la progression de la tumeur en régulant la voie PI3K-Akt dans les cellules cancéreuses de la vessie [38]. Les cellules tumorales orchestrent généralement un réseau de voies de signalisation pour maintenir leur survie face à la mort causée par un traitement anticancéreux. Lorsque la voie dominante, telle que l'EGFR, est inhibée par un TKI, les cellules tumorales ont tendance à activer l'effecteur critique en aval via des voies de signalisation de contournement, maintenant la survie et la croissance cellulaires continues [39]. Dans la présente étude, nous avons constaté que les niveaux d'expression de HDGF et de p-EGFR étaient complémentaires dans les cellules NSCLC avec ou sans perte et gain de HDGF. Le traitement par le géfitinib pourrait réduire la phosphorylation de l'EGFR mais augmenter l'expression du HDGF, activant de manière aberrante les voies PI3K/Akt et MEK/ERK. Cependant, l'inactivation du HDGF dans les cellules H1975 pourrait réactiver l'EGFR et diminuer le HDGF lorsqu'il est exposé au géfitinib, suggérant à la fois un équilibre délicat et une complémentarité entre le HDGF et le p-EGFR dans les cellules NSCLC dépendantes de l'EGFR lorsqu'elles sont exposées au géfitinib. Compte tenu de toutes les informations pertinentes, l'augmentation des niveaux de HDGF peut servir de signal de survie de contournement pour déclencher la résistance au gefitinib, et la résistance aux médicaments peut être surmontée en faisant taire HDGF.

En résumé, la présente recherche a révélé que le HDGF non seulement favorisait le phénotype malin des cellules NSCLC, mais contribuait également à la résistance au géfitinib. En tant que voie de contournement et de signalisation compensatoire, HDGF active les voies PI3K/Akt et MEK/ERK en aval de l'EGFR, qui sont associées à la résistance au géfitinib. Le ciblage du HDGF pourrait restaurer la sensibilité du géfitinib grâce à un équilibre délicat entre l'expression du HDGF et la réactivation de l'EGFR ainsi que leurs molécules partagées en aval. Par conséquent, le HDGF peut être considéré comme un mécanisme sous-jacent potentiel de la résistance au gefitinib et constitue une cible prometteuse à la fois contre le NSCLC et pour augmenter l'efficacité du TKI dans le NSCLC.

Les lignées cellulaires NSCLC humaines H1975, H157, H460, H292 et PC-9 ont été achetées auprès de l'American Type Culture Collection (Manassas, Virginie, États-Unis), tandis que les cellules A549 et H1650 ont été obtenues auprès de National Infrastructure of Cell Line Resource (Pékin, Chine). Toutes les cellules ont été maintenues dans du RPMI-1640 avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2.

Le géfitinib a été obtenu auprès d'AstraZeneca (Cheshire, Royaume-Uni). Les anticorps contre Akt (9272), ERK1/2 (9102) et p-ERK1/2 (T202/Y204) (9101) ont été achetés auprès de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). HDGF et p-Akt (Ser473) ont été obtenus auprès d'Abcam (Cambridge, Royaume-Uni). L'EGFR et le p-EGFR ont été achetés chez ABclonal (Wuhan, Chine). GAPDH, β-actine, β-tubuline et Ki-67 ont été achetés auprès de TDYbio (Beijing, Chine). Le HDGF humain recombinant (rhHDGF) a été obtenu auprès de ProSpec-Tany TechnoGene Ltd. (Israël).

Le plasmide HDGF recombinant dans le vecteur lentiviral pLenti6/TR (Invitrogen) et le plasmide de mutation pcDNA3.1-EGFR T790M ont été obtenus par clonage moléculaire. L'ARN à guide unique (sgRNA) pour HDGF a été ligaturé dans le plasmide lentiCRISPRv2. Les cellules NSCLC ont été transfectées avec un plasmide et sélectionnées pour générer une lignée cellulaire stable pour une étude plus approfondie. Les séquences pour HDGF sgRNA1, sgRNA2, sgRNA contrôle (sgRNA-Con) et d'autres amorces sont répertoriées dans les tableaux S1 et S2.

L'ARN total a été extrait à l'aide du réactif TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). La qRT‒PCR a été réalisée comme décrit précédemment [40]. Les séquences d'amorces de HDGF et GAPDH sont présentées dans le tableau S2.

L'influence de l'inactivation ou de la surexpression du HDGF, ainsi que l'induction du rhHDGF sur la croissance des cellules NSLCL, a été déterminée en comptant le nombre de cellules. Le test MTT a été utilisé pour évaluer l'inhibition de la croissance cellulaire après le traitement au géfitinib. En bref, 1 × 104 cellules dans des plaques à 96 puits ont été traitées avec du géfitinib (0, 001 ~ 50 μM) pendant 72 h. La densité optique à 570 nm a été mesurée et les valeurs IC50 ont été calculées par le logiciel GraphPad Prism 6.0 (San Diego, CA).

Les cellules ont été ensemencées dans des boîtes de culture de 6 cm à raison de 200 cellules par boîte. Après 14 jours d'incubation, les cellules ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % et colorées au cristal violet, et les colonies (diamètre > 40 μm) ont été comptées et comparées.

Les expériences ont été réalisées dans une chambre de Boyden à 24 puits comme décrit précédemment [40]. Les cellules ont été utilisées à une densité de 3 × 104 pour les tests de migration et d'invasion sans ou avec Matrigel. Des photographies de quatre champs choisis au hasard ont été prises et le nombre de cellules a été compté au microscope.

L'immunoblot a été réalisé comme décrit précédemment [22]. Les bandes de protéines ont été visualisées à l'aide d'un kit de chimiluminescence amélioré et leurs intensités ont été mesurées par le logiciel ImageJ.

Tous les animaux ont été obtenus auprès de Beijing HFK Bioscience Co. Ltd., (Chine) et ont été divisés au hasard en groupes expérimentaux en utilisant le nombre aléatoire généré par Excel. Des xénogreffes NSCLC ont été établies en inoculant des cellules par voie sous-cutanée dans un micro nude BALB/c mâle de 6 à 8 semaines (SCXK-2016-006). Lorsque les volumes tumoraux ont atteint environ 50 à 100 mm3, les souris ont été réparties au hasard et traitées comme décrit ci-dessous. À la fin du test, les souris ont été sacrifiées et le plasma et les tumeurs ont été prélevés pour une analyse plus approfondie.

Les souris ont été divisées en trois groupes et implantées avec des cellules H1975 (5 × 105) avec un contrôle sgRNA, sgRNA1 ou sgRNA2. D'autres souris ont été inoculées avec des cellules PC-9 (8 × 105) surexprimant HDGF ou son vecteur contrôle. L'effet de l'inactivation du HDGF sur l'efficacité du géfitinib dans les cellules H1975 a été évalué dans quatre groupes de souris : sgRNA-contrôle ou sgRNA2 traité avec du géfitinib (50 mg/kg) ou un véhicule. L'effet de la surexpression de l'HDGF sur l'efficacité du géfitinib dans les cellules PC-9 a été évalué dans quatre groupes : contrôle vectoriel ou surexpression de l'HDGF traité avec le géfitinib (10 mg/kg) ou le véhicule. Les données de volume tumoral ont été recueillies en aveugle. L'étudiant qui a mesuré le volume de la tumeur n'avait aucune idée de l'information du groupe.

Les concentrations de HDGF dans le plasma de souris ont été évaluées par un kit de Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Chine). Les niveaux de HDGF dans le plasma de patients NSCLC ont été déterminés par un kit ELISA de l'Anrc (Tianjin, Chine).

La procédure d'immunohistochimie (IHC) a été réalisée comme décrit ailleurs. Les coupes de tissu ont été incubées avec des anticorps contre HDGF ou Ki-67. Un anticorps secondaire anti-lapin de chèvre conjugué à la peroxydase de Jackson (West Grove, PA) a été dilué dans du PBS. La liaison spécifique a été visualisée avec le substrat de peroxydase diaminobenzidine (DAB) de Pierce (Rockford, IL).

Les données sont présentées sous forme de moyennes ± ET. Pour les études in vitro, les expériences ont été réalisées au moins en triple. Pour les études in vivo, 5 souris ont été incluses dans chaque groupe. Les données qui étaient en dehors des fourchettes des moyennes ± 3 × DS ont été exclues selon les critères préétablis. Les valeurs IC50 ont été déterminées en ajustant les données dans GraphPad Prism 6.0. Le test U de Mann‒Whitney a été réalisé pour comparer l'expression des gènes entre différents groupes, et d'autres comparaisons ont été effectuées à l'aide du test t de Student. Les valeurs de p < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. Les variances des données ont été comparées à l'aide de tests F. Le test de Mann Whitney a été utilisé pour comparer les données lorsque la valeur p des tests F est inférieure à 0,05. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées avec SPSS 18.0 (SPSS, Chicago, IL).

Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de l'étude actuelle sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Paz-Ares L, Soulières D, Melezínek I, Moecks J, Keil L, Mok T, et al. Résultats cliniques chez les patients atteints d'un cancer du poumon non à petites cellules présentant des mutations de l'EGFR : analyse groupée. J Cell Mol Med. 2010;14:51–69.